Nano đồng oxit CuO diệt nấm Phytophthora nicotianae gây bệnh đen than, thối rễ, thối trái trên cây thuốc lá, sầu riêng, cà chua, dứa và họ có múi…
Các cuộc điều tra về ứng dụng tiềm năng của các hạt nano hoạt động như thuốc diệt nấm nano trong nông nghiệp bền vững đang được mở rộng nhanh chóng do các đặc tính kháng khuẩn cao của các hợp chất này, không có nguy cơ gây ra tình trạng kháng thuốc diệt nấm của mầm bệnh . Vẫn chưa có được sự hiểu biết chi tiết về tác động của các hạt nano đồng oxit (CuO NP) đối với nấm gây bệnh thực vật trong đất. Nghiên cứu này nhằm mục đích khám phá hoạt tính kháng nấm trong ống nghiệm và hiệu quả kiểm soát của nano đồng oxit CuO NP được áp dụng thông qua tưới tiêu đối với bệnh cháy đen chân thuốc lá (TBS) do Phytophthoranicotianae gây ra . Kết quả cho thấy rằng CuO NP can thiệp rất nhiều vào quá trình sinh trưởng sinh sản của loại nấm này, ức chế sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử và sản xuất bào tử . Ngoài ra, tổn thương về hình thái, sự tích tụ ROS nội bào và tăng hoạt động của enzyme SOD trong sợi nấm là cơ chế chống nấm của các NP này. Trong các thí nghiệm trong chậu, xử lý bằng CuO NP ở mức 100 mg L -1 đã ức chế đáng kể sự phát triển của TBS, so với tác dụng đối với cây đối chứng và hiệu quả đối chứng đạt 33,69% mà không gây ra độc tính thực vật . Tiếp xúc với nano đồng oxit CuO NP đã kích hoạt đáng kể một loạt các enzyme phòng vệ và các gen kháng thuốc trong thuốc lá có thể giải thích thêm các cơ chế mà CuO NP ức chế nhiễm nấm . Hàm lượng Cu trong cả lá và rễ của cây bị nhiễm P. nicotianae đều tăng lần lượt 50,03 và 27,25% sau khi xử lý bằng 100 mg L -1 CuO NP, so với cây khỏe mạnh. Đặc biệt, hàm lượng Cu cao hơn được quan sát thấy ở rễ bị nhiễm bệnh so với ở lá. Do đó, nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của CuO NP được sử dụng làm thuốc diệt nấm nano và là chất cảm ứng nano của gen kháng nấm để quản lý TBS thông qua việc ức chế nhiễm trùng mầm bệnh và kích thích khả năng phòng vệ của cây.
- Giới thiệu
Cho đến nay, bệnh nấm chiếm khoảng 70–80% bệnh cây trồng, làm giảm đáng kể sản lượng nông nghiệp và thậm chí gây ra sự sụt giảm thảm khốc về năng suất và tác động kinh tế tiêu cực trong nông nghiệp . Người ta ước tính rằng hơn 8000 loài nấm gây bệnh thực vật đã được xác định cho đến nay ( Fisher và cộng sự, 2012 ). Phytophthoranicotianae , một loại nấm sợi thuộc lớp oomycetes , là một trong những tác nhân gây bệnh nấm trong đất đe dọa nhất và có thể tấn công rễ cây thuốc lá ( Nicotianatabacum L.) trong toàn bộ giai đoạn phát triển của chúng, gây ra mối đe dọa đối với sản xuất cây trồng trên toàn thế giới ( Bittner và Mila, 2016 ). Mặc dù nhiều chiến lược kiểm soát thay thế khác nhau đã được áp dụng để kiểm soát bảo vệ, bao gồm thuốc diệt nấm thông thường và cải thiện các biện pháp canh tác ( Ji và cộng sự, 2014 ; Fang và cộng sự, 2016 ), sự phát triển của tình trạng kháng thuốc của nấm gây bệnh và các tác động bất lợi do tiếp xúc với môi trường với thuốc diệt nấm là những mối đe dọa mới nổi đã trở thành thách thức lớn đối với sản xuất nông nghiệp. Do đó, trong những hoàn cảnh này, cần có các chiến lược quản lý bệnh hiệu quả và thân thiện hơn để đáp ứng các tiêu chí về nông nghiệp bền vững .
Gần đây, những tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong lĩnh vực vật liệu nano dùng trong nông nghiệp như các tác nhân kháng khuẩn mới có hiệu quả được cải thiện do các đặc tính vật lý và hóa học độc đáo của chúng ( Gogos và cộng sự, 2012 ). Các tác động diệt nấm/tĩnh nấm trực tiếp của nhiều hạt nano kim loại/oxit kim loại vô cơ và vật liệu nano gốc cacbon đối với các tác nhân gây bệnh nấm thực vật, nấm truyền qua thực phẩm và nấm y tế, chẳng hạn như TiO 2 , ZnO, Ag NP, oxit graphene (GO) và ống nano cacbon (CNT), đã được ghi nhận đầy đủ ( Chen và cộng sự, 2016a , 2019 ; Liu và cộng sự, 2017 ; Shenashen và cộng sự, 2017 ; Sun và cộng sự, 2018 ). Trong số các vật liệu nano này, các hạt nano oxit đồng (CuO NP), hợp chất đồng đơn giản, rẻ tiền, ổn định và dễ kiếm với diện tích bề mặt và hình thái tinh thể cao, được cho là có tác dụng ức chế các bệnh do vi khuẩn và nấm ở rễ khi áp dụng theo phương pháp nhúng hoặc phun lên lá như chất ức chế có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả ( Meghana et al. 2015 ; Devipriya và Roopan 2017 ; Borgatta et al. 2018 ; Elmer et al. 2018 ; Hao et al. 2019 ). Trước đây, nhóm của chúng tôi đã chứng minh rằng nano đồng oxit CuO NP có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Ralstoniasolanacearum có trong đất , nguyên nhân gây bệnh héo rũ do vi khuẩn ( Chen et al. 2019 ). Elmer et al. (2018) đã sử dụng CuO và các hạt nano oxit kim loại khác (AlO, FeO, MnO và ZnO) thông qua phun qua lá để kiểm soát hiệu quả các bệnh nhiễm trùng Fusariumoxysporum và Verticilliumdahliae Klebahn trên cây cà chua và cà tím được trồng trên đất bị nhiễm bệnh và chúng có độc tính với nấm hơn các thuốc thử tương ứng được sử dụng với số lượng lớn ( Elmer và White 2016 ; Malandrakis và cộng sự 2019 ). Một nghiên cứu khác đã chứng minh rằng Cu NP và CuO NP cho thấy hoạt tính với nấm mạnh đối với một số tác nhân gây bệnh nấm ở thực vật trên lá và đất, chẳng hạn như Podosphaerapannosa và Botrytiscinerea , trong ống nghiệm và trong các thử nghiệm tách rời khi phun qua lá , so với xử lý bằng TiO 2 và Fe2 O 3 ( Hao và cộng sự, 2017 , 2019 ). Ngoài ra, Giannousi và cộng sự (2013) phát hiện ra rằng các hạt nano tổng hợp Cu/Cu 2 O thể hiện hoạt động diệt nấm ổn định hơn đối với bệnh mốc sương ở cà chua invivo so với Cu hoặc Cu 2 O riêng lẻ ( Giannousi và cộng sự, 2013 ).
Quan trọng nhất, là một nguyên tố khoáng vi lượng thiết yếu, đồng đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt phản ứng phòng vệ của thực vật chống lại bệnh tật, côn trùng và căng thẳng phi sinh học ( Sathiyabama và Manikandan 2018 ). Kết quả này là kết quả của sự tham gia của đồng vào phản ứng oxy hóa khử ở thực vật, tạo thành cuprin, tham gia vào quá trình quang hợp và là thành phần quan trọng của các enzyme phòng vệ ( Sathiyabama và Manikandan 2018 ; Shang và cộng sự, 2020 ). Mặc dù độc tính nano của Cu đã được báo cáo, nhưng vật liệu nano gốc Cu liều thấp thúc đẩy mạnh mẽ sự sinh trưởng và năng suất của một số loại cây trồng và làm tăng sự hấp thụ và vận chuyển Cu trong cả nhà kính và thử nghiệm thực địa ( Rastogi và cộng sự, 2017 ; Toqeer và cộng sự, 2020 ; Wang và cộng sự, 2020 ). Đáng chú ý là cơ chế của vật liệu nano Cu chống lại bệnh tật dưới dạng thuốc trừ sâu nano, tạo ra khả năng kháng mầm bệnh, có liên quan đến việc điều hòa tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng phòng vệ của thực vật dưới tác nhân gây bệnh, chẳng hạn như ở dưa hấu và cà chua bị nhiễm Fusarium , dẫn đến sự chuyển vị hiệu quả hơn qua lớp biểu bì, bất kể thành phần (phosphate so với oxide) ( Borgatta và cộng sự, 2018 ; Ma và cộng sự, 2020 ). Tuy nhiên, mặc dù nhiều nghiên cứu trong ống nghiệm đã được thực hiện, nhưng điều quan trọng cần nhớ là vật liệu nano luôn tạo ra các tác động sinh học tùy thuộc vào loài thực vật, cũng như loại hạt nano, nồng độ tiếp xúc và quy trình ứng dụng. Chưa có nghiên cứu có hệ thống nào được tiến hành về đặc tính chống nguyên phân của CuO NP đối với nấm gây bệnh P. nicotianae trong đất . Ngoài ra, đáng chú ý là các nghiên cứu hiện có đã áp dụng Cu ở kích thước nano dưới dạng thuốc phun qua lá invivo và thông tin về việc quản lý bệnh cây trồng bằng hạt nano thông qua ứng dụng trên đất vẫn còn phần lớn chưa rõ ràng. Khi xem xét những lợi thế đáng kể của NP so với thuốc diệt nấm truyền thống, cần phải hiểu biết toàn diện về cách NP ảnh hưởng đến mầm bệnh, cây chủ và kiểm soát bệnh tật để ứng dụng hiệu quả trong nông nghiệp ( Giannousi et al. 2013 ).
Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là điều tra các đặc tính độc nấm trong ống nghiệm của CuO NP đối với P. nicotianae và hiệu quả kiểm soát bệnh khi tưới rễ bằng CuO NP dựa trên các nghiên cứu trong nhà kính. Sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây thuốc lá cũng được đánh giá khi có các hạt nano này. Hơn nữa, ở những cây khỏe mạnh và bị nhiễm bệnh tiếp xúc với CuO NP, hàm lượng Cu trong mô thực vật được xác định bằng phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) và các phản ứng phòng vệ bằng enzym và phân tử (mức độ phiên mã của các gen liên quan đến phòng vệ) đã được định lượng để xác nhận khả năng của các NP này trong việc kích thích khả năng kháng bệnh của cây thuốc lá . Các kết quả mở rộng tầm hiểu biết về cơ chế của CuO NP chống lại các tác nhân gây bệnh thực vật và cho thấy triển vọng về ứng dụng tiềm năng của các hạt nano trong một chiến lược quản lý bệnh thay thế nhằm cải thiện các ứng dụng nông nghiệp bền vững trong tương lai.
- Vật liệu và phương pháp
2.1 . Đặc tính hạt nano đồng oxit
Hạt nano CuO (40 nm, độ tinh khiết 99,00%) được mua từ Công ty TNHH Thương mại Sigma-Aldrich (Thượng Hải, Trung Quốc). Hạt nano CuO được phân tán trong nước cất có chứa chất hoạt động bề mặt không ion (1 mL/L -1 ) để thu được một loạt huyền phù cô đặc. Sau khi siêu âm trong 5 phút, hình thái hạt được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, Hitachi HT7800, Nhật Bản). Đường kính của hạt nano CuO dao động từ 10 đến 100 nm, với một số kết tụ (Phụ lục A).
2.2 . Nuôi cấy Phytophthora nicotianae và cảm ứng sinh bào tử
Nấm gây bệnh thực vật P. nicotianae được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Trọng điểm Nhà nước về Sinh học Căng thẳng Cây trồng cho Vùng Khô hạn, Đại học Nông nghiệp và Lâm nghiệp Tây Bắc. Phytophthora nicotianae được nuôi cấy ngược trên môi trường thạch yến mạch (OA) ở 28°C trong tủ ấm điều nhiệt liên tục trong bóng tối để thu được chủng vi khuẩn dùng trong các xét nghiệm độc tính nấm.
Bào tử nấm Phytophthora nicotianae được nuôi cấy như sau: Đầu tiên, tất cả các dụng cụ và vật liệu thủy tinh được sử dụng trong thí nghiệm đều được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 30 phút để khử trùng hoàn toàn trước khi sử dụng. Dịch cấy Phytophthora nicotianae được nuôi cấy thông thường trong 4 ngày được chuyển vào đĩa Petri chứa môi trường sinh bào tử động vật đã được khử trùng bao gồm 0,004 mmol L -1 MgSO4 · 7H 2 O , 0,05 mmol L -1 KNO3 và 1 mL Fe-EDTA trong 1 L nước siêu tinh khiết. Giá trị pH được điều chỉnh bằng axit 2-(n-morpholine) ethylsulfonic đến 6,0. Sau đó, hỗn hợp dịch cấy được nuôi cấy trong tủ ấm chiếu sáng ở 26°C với 24 giờ chiếu sáng liên tục cho đến khi quan sát thấy sản sinh bào tử hàng loạt. Sau khi loại bỏ môi trường cảm ứng, dịch cấy được duy trì ở 4°C trong 15 phút và sau đó ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Cuối cùng, một lượng lớn bào tử được giải phóng khỏi túi bào tử bằng cách thổi nhẹ bằng pipet chứa nước khử ion. Sau đó, dịch huyền phù bào tử được lọc qua ba lớp gạc vô trùng, thu thập bằng cách ly tâm và đếm bằng máy đếm tế bào. Mật độ bào tử được xác định trong nước cất là khoảng 1×106 bào tử mL -1 .
2.3 . Độc tính nấm trong ống nghiệm của nano đồng oxit CuO NP đối với P. nicotianae
Hoạt động kháng nấm của CuO NP được đánh giá bằng cách đo sự phát triển sinh dưỡng và sinh sản của nấm về mặt ức chế sự phát triển của nấm, sự nảy mầm của bào tử và sự hình thành túi bào tử ( Chen et al. 2020 ).
Thử nghiệm ức chế sinh trưởng sợi nấm: Một miếng bánh sợi nấm P. nicotianae hình tròn (khoảng 0,6 cm) cắt từ mép của một khuẩn lạc nấm 5 ngày tuổi được cấy lên môi trường thạch yến mạch (OA) được xử lý với các nồng độ khác nhau (0, 6,25, 12,5, 25, 50 và 100 mg/L ) hạt nano CuO. Tất cả các đĩa nuôi cấy được giữ trong bình giữ nhiệt ở 28°C trong 72 giờ trong bóng tối, và đường kính khuẩn lạc sợi nấm được đo. Tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm được tính theo công thức sau:
Tỉ lệ ức chế tăng tăng trưởng sợi nấm (%)= (C-T)*100/C
trong đó C biểu thị đường kính trung bình của khuẩn lạc trong nhóm đối chứng và T biểu thị đường kính trung bình của khuẩn lạc trong các nhóm được xử lý bằng CuO NP ở nồng độ khác nhau.
Ngăn ngừa sự hình thành bào tử Tóm lại, nano đồng oxit CuO NP được thêm vào môi trường tạo bào tử để đạt được nồng độ đã thử nghiệm trong thí nghiệm được mô tả ở trên, lắc và khử trùng, sau đó 3 mL huyền phù được đổ vào đĩa nuôi cấy có đường kính trong là 8,0 cm. Là mẫu đối chứng, cùng một thể tích nước vô trùng đã được sử dụng trong thí nghiệm. Sau đó, ba nút nấm có cùng kích thước được nuôi trong 15 ngày trên môi trường OA đã được cấy vào mỗi đĩa. Tất cả các đĩa chưa xử lý và đã xử lý đều được niêm phong bằng parafilm, sau đó tiếp xúc với ánh sáng ủ ở 26°C trong 24 giờ để kích thích sự hình thành bào tử. Cuối cùng, số lượng bào tử được đếm và hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi Leica DMI 300B (Leica, Đức).
Thử nghiệm nảy mầm bào tử Tương tự như vậy, 10 μL nồng độ khác nhau của CuO NP và cùng một thể tích huyền phù bào tử P. nicotianae (1×106 bào tử mL -1 ) được đồng thời cấy trên các phiến kính rỗng, đã được làm sạch bằng etanol. Các phiến kính được đặt trong đĩa nuôi cấy và phủ giấy lọc đã ngâm ở đáy để duy trì độ ẩm tương đối 85–95% trong quá trình nảy mầm. Sau 4 giờ ủ ở 26°C trong điều kiện hoàn toàn tối, tỷ lệ nảy mầm của bào tử được theo dõi dưới kính hiển vi quang học (Leica, Đức). Thông thường, sự xuất hiện của ống mầm (một nửa chiều dài bào tử) là tiêu chí để đánh giá sự nảy mầm của bào tử.
2.4 . Quan sát hình thái sợi nấm bằng SEM/EDS và TEM
Những thay đổi về hình thái sợi nấm Phytophthora nicotianae đã được quan sát bằng công nghệ SEM và TEM như đã mô tả trước đây. Một khối P. nicotianae đã được cấy vào môi trường thạch đã xử lý bằng CuO NP 50 mg L -1 và nuôi cấy trong 72 giờ. Các mẫu sợi nấm P. nicotianae đã được thu thập từ mép của các đĩa và cố định ngay lập tức trong glutaraldehyde 3% trong đệm natri phosphat (100 mmol L -1 , pH 7,4) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau khi rửa bằng đệm nhiều lần, các mẫu đã được cố định sau bằng osmium tetroxide 1% trong 2 giờ ở 4°C. Tiếp theo, các sợi nấm đã dần dần được khử nước trong một loạt etanol được phân loại, từ 30 đến 100%, trong 10 phút. Các mẫu đã cố định đã được sấy khô và thực hiện quy trình phun phủ vàng. Sau đó, các mẫu được gửi đến mô hình FEI Quanta 200 SEM để kiểm tra.
Để quan sát TEM, sợi nấm P. nicotianae được khử nước, nhúng trong nhựa epoxy và cắt bằng máy cắt lát siêu mỏng (RMC) để thu được các lát cắt siêu mỏng. Sau đó, tất cả các lát cắt được nhuộm sau bằng 2% uranyl acetate trong 10 phút và 2% chì citrate trong 10 phút nữa. Các mẫu được đặt trên lưới đồng và kiểm tra trên máy TEM JEM-200 CX (JEOL) ở điện áp tăng tốc 100 kV (SIA, Đức).
2.5 . Thử nghiệm khả năng sống của sợi nấm
Theo một nghiên cứu trước đây ( Chen và cộng sự, 2014 ), khả năng sống của tế bào nấm được đánh giá bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang. Sợi nấm Phytophthora nicotianae được trộn với dung dịch CuO NP dự trữ (100 mg L -1 ) và ủ ở 28°C trong 4 giờ. Một nhóm sợi nấm không xử lý được dùng làm nhóm đối chứng. Độ nhạy cảm của sợi nấm tiếp xúc với hạt nano cũng như của tế bào bình thường được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang (DM750, Leica Co., Đức), sau đó nhuộm diamidine phenyl indole (DAPI) và propidium iodide (PI).
2.6 . Xác định nồng độ ROS nội bào và hoạt động của enzyme superoxide dismutase (SOD)
Sự tạo ra ROS nội bào được đo bằng cách thực hiện xét nghiệm với 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate không huỳnh quang (H 2 DCFDA, Invitrogen, Hoa Kỳ), một chất chỉ thị stress oxy hóa, theo báo cáo của Chen và cộng sự (2014) . Sợi nấm P. nicotianae tươi được thu thập và tiếp xúc với nano đồng oxit CuO NP ở nồng độ 100 mg L -1 trong các ống ly tâm ở 28°C trong 4 giờ. Sợi nấm được bổ sung nước khử ion vô trùng là đối chứng dương. Sau đó, 10 μmol L -1 H 2 DCFDA được thêm vào mỗi ống và các mẫu thử nghiệm được ủ trong bóng tối trong 20 phút rồi rửa sạch. Sợi nấm được tách ra và kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang (DM750, Leica Co., Đức) ở bước sóng kích thích là 488 nm và bước sóng phát xạ là 535 nm.
Đối với xét nghiệm enzyme SOD , 0,2 g sợi nấm được nghiền bằng nitơ lỏng trong cối, và dịch đồng nhất được ly tâm nhanh ở tốc độ 12000 × g ở 4°C trong 20 phút. Phần dịch nổi được sử dụng để đo hoạt tính enzyme SOD, được thực hiện bằng Bộ xét nghiệm hoạt tính SOD (BioVision, Hoa Kỳ), và phản ứng được đo bằng máy đọc vi mạch (Thermo Varioskan Flash, Hoa Kỳ) ở bước sóng 505 nm. Ba lần lặp lại cho mỗi phương pháp xử lý đã được chuẩn bị. Ngoài ra, các thí nghiệm song song đã được tiến hành, trong đó một loạt liều lượng histidine, một chất chống oxy hóa, được áp dụng cho sợi nấm tiếp xúc với CuO NP để ức chế sản xuất SOD.
2.7 . Thử nghiệm tiêm chủng mầm bệnh và kiểm soát bệnh invivo
Hạt giống thuốc lá (Yunyan 87) trước tiên được khử trùng bằng cồn etylic 75% trong 30 giây, sau đó ngâm trong H 2 O 2 30% trong 10 phút nữa. Sau đó, hạt giống được trồng vào hệ thống cây con nổi có chứa giá thể thương mại (Công ty TNHH Phát triển Kỹ thuật Nông nghiệp Hunan Xianghui) và phát triển cho đến giai đoạn 4–5 lá thật. Tiếp theo, 10 mL huyền phù bào tử (104 bào tử mL -1 ) được thêm vào mỗi cây bằng phương pháp tưới đẫm đất. Tổng cộng 10 mL CuO NP ở các nồng độ khác nhau được tưới bằng cách tưới sau 24 giờ sau khi tiêm chủng. Các cây được xử lý bằng nước cất vô trùng là đối chứng. Mười sáu cây có kích thước đồng đều được đưa vào mỗi lần xử lý. Tỷ lệ mắc bệnh được nghiên cứu khi xuất hiện lá héo và thân hoại tử, tức là 2 ngày sau khi xử lý CuO NP trong thí nghiệm của chúng tôi, theo định nghĩa của Litton dựa trên thang điểm đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh từ 0–4. Do đó, hiệu quả kiểm soát được tính toán dựa trên tài liệu.
2.8 . Xác định sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng phòng vệ của thực vật bằng qPCR
Đối với phân tích thay đổi biểu hiện gen, 0,1 g mô rễ tươi được thu thập sau khi cây thuốc lá được xử lý bằng nano đồng oxit CuO NP bị nhiễm trong 1, 3, 5 và 7 ngày. Tổng RNA được chiết xuất bằng Bộ RNA tổng số thực vật Sigma-Aldrich Spectrum (St. Louis, MO) và nồng độ RNA thu được được xác định bằng Máy đọc vi mảng Thermo Scientific (Thermo Varioskan Flash, Hoa Kỳ). Bộ tổng hợp cDNA iScript™ (Bio-Rad, Hoa Kỳ) được sử dụng để phiên mã ngược một phần 2 μL RNA. Các đoạn mồi của gen được liệt kê trong Phụ lục B. Sau đó, biểu hiện của một số gen thuốc lá có liên quan đến phản ứng phòng vệ của thực vật được xác định bằng Bộ RT-qPCR một bước (Bio-Rad, Hoa Kỳ) theo quy trình dưới đây. PCR được chạy theo quy trình đã thiết lập với việc biến tính trước DNA ở 95°C trong 3 phút và biến tính ở 90°C trong 10 giây. Tiếp theo, 40 chu kỳ PCR ở 60°C trong 30 giây và sau đó ở 95°C trong 10 giây được thực hiện để kết thúc phản ứng. DNA được định lượng bằng cách đo huỳnh quang ở cuối mỗi chu kỳ. Biểu hiện tương đối của các gen được chọn được phân tích bằng phương pháp 2 −ΔΔCT , trong đó L25 được sử dụng làm gen quản gia.
2.9 . Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu thực nghiệm được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của ba quan sát riêng lẻ với độ lệch chuẩn (SD) và ý nghĩa thống kê ( P <0,05 và P <0,01) trong số tất cả các phương pháp xử lý được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA một chiều) tiếp theo là kiểm định Duncan (SPSS 19.0, Chicago, IL, Hoa Kỳ).
- Kết quả
3.1 . Vô hiệu hóa sự phát triển của sợi nấm P. nicotianae
Tác dụng ức chế của CuO NP đối với sự phát triển của P. nicotianae được xác định bằng cách đánh giá đường kính khuẩn lạc sợi nấm sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch. Như quan sát trực quan trong Hình 1-A , so với mẫu không được xử lý, các khuẩn lạc bao phủ toàn bộ đĩa và đường kính khuẩn lạc sợi nấm, với giá trị 6,23, 6,18 và 5,65 cm, rõ ràng không bị ảnh hưởng bởi xử lý CuO NP ở nồng độ 6,25–25 mg L -1 ; tuy nhiên, sự giảm đáng kể đã được quan sát thấy trong các mẫu tiếp xúc với CuO NP ở nồng độ cao hơn là 50 và 100 mg L -1 . Đường kính giảm xuống còn 4,06 và 0 cm với tỷ lệ ức chế tăng trưởng lần lượt là 38,87 và 100%. Đáng chú ý, 100 mg L -1 CuO NP cho thấy sự bất hoạt hoàn toàn (tỷ lệ ức chế 100%) đối với sợi nấm P. nicotianae .
Hình 1. Tác dụng kháng nấm của các nồng độ hạt nano đồng oxit (CuO NP) khác nhau trên nấm Phytophthora nicotianae . A, khuẩn lạc nấm P. nicotianae phát triển trên đĩa thạch OA sau khi tiếp xúc với các nồng độ hạt nano đồng oxit CuO khác nhau (0–100 mg/L ). B, đường kính khuẩn lạc nấm. C, tỷ lệ ức chế sự phát triển của nấm sau 72 giờ ủ mẫu nấm với hạt nano CuO. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). * biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm được xử lý và nhóm đối chứng (P < 0,05).
3.2 . Ức chế sự hình thành túi bào tử và sự nảy mầm của bào tử
Sporangia, một dạng sinh sản vô tính của P. nicotianae , có thể nảy mầm trực tiếp thông qua quá trình sản xuất sợi nấm trên mô vật chủ hoặc giải phóng nhiều bào tử động , bào tử vô tính di động, để hình thành sợi nấm sinh dưỡng, và khoảng 8–20 bào tử động được tạo ra bởi một túi bào tử , nảy mầm nhanh chóng để tạo ra sợi nấm mới ( Judelson và Blanco 2005 ). Kiểm tra trực quan các tác động lên sự hình thành túi bào tử và sự nảy mầm của bào tử là một phương pháp sơ bộ hữu ích để đánh giá hoạt động diệt nấm của nano đồng oxit CuO NP. Ngược lại với mẫu không được xử lý, nano đồng oxit CuO NP làm giảm đáng kể và dần dần số lượng bào tử khi nồng độ tiếp xúc tăng (6,25–100 mg L −1 ): Số lượng bào tử trung bình là 140, 44, 25, 5 và 0, giảm lần lượt là 42,61, 76,70, 86,78, 97,04 và 100% ( Hình 2-B ), chứng tỏ rằng CuO NP ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh bào tử của P. nicotianae .
Hình 2. Tác động của hạt nano oxit đồng (CuO NP) lên quá trình hình thành bào tử và nảy mầm bào tử của Phytophthora nicotianae . A, quan sát bào tử nang dưới kính hiển vi quang học sau khi xử lý bằng các nồng độ CuO NP khác nhau trong 24 giờ như được chỉ ra bởi các mũi tên màu vàng. B, số lượng bào tử nang trung bình trong số các chủng P. nicotianae. C, tốc độ ức chế của CuO NP đối với sự hình thành bào tử nang. D, tác động của CuO NP lên quá trình nảy mầm bào tử của bào tử P. nicotianae được quan sát bằng kính hiển vi quang học. Mũi tên màu đỏ chỉ ra các tập hợp CuO NP trong hỗn hợp. E, tốc độ nảy mầm của bào tử khi có mặt các nồng độ CuO NP khác nhau. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). * và ** biểu thị sự khác biệt đáng kể ở P < 0,05 và P < 0,01 giữa nhóm được xử lý và nhóm đối chứng.
Tương tự, nhìn chung, khi nồng độ phơi nhiễm tăng lên, tỷ lệ nảy mầm của bào tử bị ức chế đáng kể khi ủ với CuO NP ( Hình 2-D ). Tỷ lệ nảy mầm của bào tử không bị ảnh hưởng về mặt thống kê sau khi tiếp xúc với CuO NP ở mức 6,25 và 12,5 mg L -1 nhưng giảm 11,59, 9,29, 87, 89,6 và 95,7% ở liều xử lý cao hơn, lần lượt là 25–100 mg L -1 , so với nhóm đối chứng. Một giả thuyết khác cho rằng ở nồng độ cao hơn, NP có nhiều cơ hội tương tác với bào tử hơn, như được chỉ ra bởi các mũi tên màu đỏ trong Hình 2-D .
3.3 . Quan sát hình thái sau khi tiếp xúc với sợi nấm P. nicotianae với nano đồng oxit CuO NP
Hình ảnh SEM và TEM đã được thực hiện để so sánh đặc điểm hình thái của sợi nấm P. nicotianae chưa xử lý và đã xử lý bằng CuO NP . Như thấy trong Hình 3-A , sợi nấm không xử lý nào cho thấy sự mịn màng và toàn vẹn tự nhiên, trong khi các mẫu tiếp xúc với CuO NP cho thấy các dấu hiệu hư hại thành tế bào, chẳng hạn như các đặc điểm lồi lõm thô ráp của màng tế bào kèm theo sự sụp đổ một phần rõ ràng và quanh co ( Hình 3-B–B2 ). Quan sát này phù hợp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy sự tương tác vật lý giữa các tế bào vi khuẩn R. solanacearum và CuO NP và MgO NP ( Cai và cộng sự, 2018 ; Chen và cộng sự, 2019 ). Do đó, thật thú vị khi suy đoán liệu CuO NP có thể tiếp xúc với các tế bào P. nicotianae hay không , như được chỉ ra bằng các mũi tên trong Hình 3-B , trong đó một số tập hợp nhỏ đã được quan sát thấy. Phổ EDS đã được thực hiện để xác minh bản chất hóa học của các tập hợp này. Kết quả cho thấy có một lượng nguyên tử đồng nhất định trong các tập hợp, đảm bảo sự tồn tại của CuO NP trên bề mặt sợi nấm P. nicotianae , như được chỉ ra bởi các mũi tên trong Hình 3-C và D.
Hình 3. Ảnh TME của sợi nấm Phytophthora nicotianae. A và B, hình thái sợi nấm P. nicotianae khi không tiếp xúc (A) hoặc có tiếp xúc (B) với 50 mg L -1 nano đồng oxit (CuO NP). A1, A2 và B1, B2, mẫu vật ở độ phóng đại cao hơn. Xử lý nano đồng oxit CuO NP ức chế sự phát triển của sợi nấm và gây ra sự phình to bất thường (mũi tên trắng). C và D, CuO NP hấp phụ trên bề mặt thể nấm (C) và phân tích SEM-EDS được thực hiện trực tiếp trên CuO NP (D).
Ngoài ra, hình ảnh TEM của các tế bào nấm được xử lý bằng hạt nano CuO đã được chụp nhằm mục đích quan sát cấu trúc siêu nhỏ của tế bào. Ngược lại với các mẫu chưa được xử lý, có tế bào chất dày đặc và màng tế bào tích hợp, hiện tượng rỗng và tổn thương thành tế bào được tìm thấy ở nhiều vị trí trong các tế bào sợi nấm được xử lý bằng 50 mg L -1 CuO NP, cho thấy sợi nấm P. nicotianae bị tổn thương đáng kể ( Hình 4-A và C ). Những thay đổi này trong các tế bào sợi nấm tương ứng với kết quả SEM. Như thể hiện trong Hình 4-E và F, khi 100 mg L -1 CuO NP tương tác với sợi nấm, các tập hợp hạt nano đồng oxit CuO bám dính rõ ràng vào thành tế bào nấm bên ngoài tế bào (được chỉ ra bằng mũi tên màu đỏ) và thậm chí xuyên qua màng tế bào, có thể là do tương tác tĩnh điện và tốc độ lắng đọng nhanh hơn của chúng ( Chen và cộng sự, 2020 ).
Hình 4. Ảnh TME của sợi nấm Phytophthora nicotianae. A, C và E, sợi nấm P. nicotianae tiếp xúc với nước khử trùng (A), hạt nano oxit đồng 50 mg/L ( CuO NP) (C) và hạt nano đồng oxit CuO 100 mg/L (E). B, D và F là hình ảnh kính hiển vi tương ứng dưới độ phóng đại cao. Mũi tên đỏ thể hiện sự bám dính của hạt nano CuO trên bề mặt thành tế bào; mũi tên đen chỉ tổn thương một phần màng tế bào.
3.4 . Tổn thương màng sợi nấm Phytophthora nicotianae sau khi xử lý CuO NP
Sự khử trùng của sợi nấm P. nicotianae do nano đồng oxit CuO NP gây ra đã được xác nhận bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng sống của tế bào sinh học trong các nghiên cứu độc tính vật liệu nano ( Pan và cộng sự, 2013 ; Chen và cộng sự, 2014 ). Sau khi nhuộm bằng propid iumiodide (PI), một loại tác nhân nhuộm hạt nhân có khả năng xuyên qua màng tế bào bị tổn thương và nhúng vào DNA sợi đôi và thường được sử dụng để phát hiện apoptosis tế bào thông qua huỳnh quang đỏ phát ra. Có huỳnh quang đỏ không đáng kể phát ra từ các sợi nấm sau khi chết mà không có sự hiện diện của CuO NP, trong khi hầu hết các sợi nấm tiếp xúc với 50 mg L -1 CuO NP đều nhuộm màu đỏ nhạt bằng thuốc nhuộm PI, cho thấy phần lớn các tế bào chết ( Hình 5 ) chắc chắn bị ảnh hưởng bởi sự phá hủy màng tế bào do sự bám dính của CuO NP, như đã quan sát thấy trong các hình ảnh SEM và TEM đã đề cập ở trên.
Hình 5. Tác động của hạt nano đồng oxit (CuO NP) lên sợi nấm Phytophthora nicotianae . A, tổn thương màng sợi nấm P. nicotianae chưa xử lý và đã xử lý 50 mg L -1 CuO NP được phát hiện bằng hình ảnh huỳnh quang sau khi nhuộm bằng propidium iodide. Huỳnh quang màu đỏ trong hình chỉ ra rằng màng tế bào sợi nấm đã bị phá vỡ. B, đo ứng suất oxy hóa trong nước khử ion vô trùng (mẫu đối chứng) và mẫu P. nicotianae đã xử lý 50 mg L -1 CuO NP bằng kính hiển vi huỳnh quang . Huỳnh quang màu xanh lá cây biểu thị sự sản xuất các loài oxy phản ứng tương đối (ROS). C, tỷ lệ ức chế của chất chống oxy hóa histidine lên hoạt tính kháng nấm của 50 mg L -1 CuO NP. D, Hoạt động SOD của tế bào nấm khi có mặt 0, 6,25, 12,5, 25, 50 và 100 mg L -1 CuO NP. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). * và ** biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P < 0,05 và P < 0,01 giữa nhóm được điều trị và nhóm đối chứng.
3.5 . Sản xuất ROS để đáp ứng với xử lý nano đồng oxit CuO NP
Sự tích tụ ROS, cụ thể là superoxide (O 2 − ·), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) và OH · , đã được đo để xác định stress oxy hóa nội bào trong các tế bào sinh học do các hạt nano oxit kim loại gây ra ( Bhabra et al. 2009 ). Thuốc thử không huỳnh quang H 2 DCFDA được sử dụng làm chất chỉ thị trong xét nghiệm này; khi nó bị oxy hóa thành DCF, phát ra ánh sáng xanh lục. Như thể hiện trong Hình 5 , so với sợi nấm P. nicotianae chưa được xử lý , huỳnh quang xanh lục mạnh hơn đã được phát ra từ các tập hợp sợi nấm-hạt nano ( Hình 5-B ). Tuy nhiên, điều thú vị cần lưu ý là cường độ huỳnh quang bị ức chế đáng kể khi chất chống oxy hóa histidine được thêm vào ở các nồng độ khác nhau (0,5, 1, 2 và 3 g L −1 ) vào các sợi nấm tiếp xúc với CuO NP ( Hình 5-C ). Bởi vì histidine góp phần giải độc ROS và điều chỉnh cân bằng α-ketoglutarate ở vi khuẩn để đáp ứng với stress oxy hóa ( Lemire et al. 2010 ).
Ngoài ra, người ta cũng biết rằng một số enzyme chống oxy hóa , chẳng hạn như superoxide dismutase nội bào (SOD), glutathione peroxidase và thioredoxin peroxidase, có liên quan đến việc loại bỏ trực tiếp O 2 và H 2 O 2 để duy trì cân bằng oxy hóa khử trong tế bào. Như thể hiện trong Hình 5-D , hoạt động SOD trong sợi nấm P. nicotianae dần được cải thiện khi nồng độ xử lý của CuO NP tăng lên; nghĩa là, nó cho thấy các hiệu ứng phụ thuộc vào nồng độ. Hoạt động SOD tăng 1,1, 2,7, 3,7 và 5,3 lần khi có mặt CuO NP được áp dụng ở các liều lượng khác nhau. Tuy nhiên, các sợi nấm cực kỳ dễ bị ảnh hưởng bởi các hạt nano, với hầu hết đều chết, như được chỉ ra bằng quan sát bằng kính hiển vi điện tử (Hình 3 và 4). Về vấn đề này, có thể cho rằng hệ thống phòng thủ của nấm được kích thích để chống lại tình trạng căng thẳng oxy hóa do CuO NP gây ra ( Elmer và cộng sự, 2018 ; Kumari và cộng sự, 2019 ).
3.6 . Ức chế bệnh nấm trong thí nghiệm nhà kính
Trong các thí nghiệm trong chậu, vai trò của nano đồng oxit CuO NP trong việc ức chế bệnh TBS invivo đã được xác định để xác minh kết quả của thí nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy độc tính nấm của CuO NP. Sau khi tiêm chủng với P. nicotianae , cây con thuốc lá được tiếp xúc với 6,25–100 mg L -1 CuO NP thông qua tưới tiêu và mức độ nghiêm trọng của bệnh chân đen được đánh giá bằng chỉ số bệnh. Như dự kiến, ở những cây bị nhiễm P. nicotianae , không có thay đổi nào về chỉ số bệnh khi xử lý liều thấp (6,25–25 mg L -1 ) và ít ảnh hưởng đến việc kiểm soát bệnh so với cây đối chứng ( Hình 6-B ). Tuy nhiên, việc xử lý bằng 50 và 100 mg L -1 CuO NP dẫn đến việc ức chế bệnh đáng kể, với hiệu quả kiểm soát lần lượt là 6,52 và 33,69% vào cuối thí nghiệm. Kết quả từ các thí nghiệm trong chậu phù hợp với kết quả của thử nghiệm in vitro về độc tính của các hạt nano đối với P. nicotianae . Có những tác động tiêu cực không đáng kể đến các tác nhân gây bệnh tiếp xúc với nồng độ thấp của CuO NP, không có tác động đến sự phát triển sinh sản của các tác nhân gây bệnh. Hình ảnh đại diện về sự ức chế bệnh chân đen sau 8 dpi được trình bày trong Hình 6-A . Rõ ràng, cây con thuốc lá chưa được xử lý đã phát triển các triệu chứng kraurotic và héo, trong khi hầu hết các cây vẫn giữ được màu xanh tươi, mặc dù lá già có hiện tượng vàng lá sau khi tưới nước. Quan trọng nhất là không có sự khác biệt đáng kể nào về tỷ lệ nảy mầm của hạt và các chỉ số hình thái giữa các phương pháp xử lý sau khi tiếp xúc với CuO NP trong 30 ngày trong điều kiện nhà kính (Phụ lục C và D), cho thấy ưu điểm là không độc hại.
Hình 6. Hiệu quả kiểm soát của hạt nano oxit đồng (CuO NP) đối với bệnh đen thân trong điều kiện nhà kính. A, hình ảnh đại diện cho thấy sự xuất hiện của bệnh đen thân thuốc lá sau khi tiếp xúc với CuO NP vào ngày thứ 8 sau khi tiêm chủng (dpi) trong điều kiện nhà kính. B, chỉ số bệnh đen thân thuốc lá sau khi xử lý bằng nồng độ CuO NP đã thử nghiệm. C, hiệu quả kiểm soát của nano đồng oxit CuO NP đối với bệnh đen thân thuốc lá (TBS). D, cảm ứng hoạt động của enzyme phòng vệ ở rễ thuốc lá chưa xử lý và bị nhiễm Phytophthora nicotianae bằng cách tưới ứng dụng CuO NP ở các nồng độ khác nhau (50 và 100 mg L -1 ). PPO , polyphenol oxidase; PAL , phenylalanine ammonia-lyase; POD , peroxidase; CHI , chalcone isomerase. Thanh lỗi biểu thị sai số chuẩn của giá trị trung bình (n = 3). * và ** biểu thị sự khác biệt đáng kể ở P < 0,05 và P < 0,01 giữa phương pháp đối chứng và phương pháp xử lý CuO NP.
3.7 . Hoạt động của enzyme bảo vệ thực vật
Hoạt động của một số enzyme chống oxy hóa trong rễ thuốc lá đã được nghiên cứu để đánh giá phản ứng của cây đối với các phương pháp xử lý nano đồng oxit CuO NP hiệu quả (50 và 100 mg L -1 ) trong một nghiên cứu trong nhà kính. Như thể hiện trong Hình 6-D , khi không có phương pháp xử lý NP, việc tiêm chủng P. nicotianae làm tăng đáng kể hoạt động của polyphenol oxidase (PPO) và chalcone isomerase (CHI) trong rễ lần lượt là 0,62 và 1,23 lần, nhưng hoạt động của phenylalanine ammonia-lyase (PAL) và peroxidase (POD) vẫn không thay đổi hoặc giảm, cho thấy rằng chỉ riêng tác nhân gây bệnh nấm đã kích hoạt vừa phải khả năng miễn dịch của thực vật. Điều thú vị là việc bổ sung CuO NP vào nước tưới đã làm tăng cường phản ứng kháng thuốc của cây thuốc lá đối với P. nicotianae . Ở những cây bị nhiễm bệnh, hoạt động của PPO, POD, PAL và CHI trong rễ tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của CuO NP được điều chỉnh tăng đáng kể so với nhóm đối chứng bị bệnh, cụ thể là tăng lần lượt 91,6, 37, 33,8 và 65,1% trong phương pháp xử lý 100 mg L -1 CuO NP, có thể là do sử dụng liều lượng lớn NP. Trong điều kiện khỏe mạnh (không có tác nhân gây bệnh), mức độ enzyme phòng vệ của thực vật đều không bị ảnh hưởng về mặt thống kê bởi các phương pháp xử lý, kết quả có thể liên quan đến nồng độ ứng dụng của NP, tương tự như xử lý đậu nành bằng NM gốc Cu ( Ma et al. 2020 ). Bởi vì CuO NP cho thấy triển vọng là chất kích thích phòng vệ thực vật cho phép nano để thúc đẩy sức khỏe cây trồng, đặc biệt là khi có tác nhân gây bệnh ( Ma et al. 2020 ; Sarkar et al. 2020 ).
3.8 . Biểu hiện gen phản ứng phòng vệ
Để xác nhận kết quả trên cho thấy nano đồng oxit CuO NP có thể kích thích khả năng kháng bệnh ở cây thuốc lá, sự biểu hiện của năm gen liên quan đến khả năng phòng vệ của thực vật ở rễ đã được nghiên cứu. Như thể hiện trong Hình 7 , điều quan trọng cần lưu ý là mức độ phiên mã của các gen được thử nghiệm ở rễ thuốc lá rất năng động và thay đổi theo thời gian xử lý. Tiếp xúc rễ với CuO NP ở mức 50 mg L -1 không ảnh hưởng đến biểu hiện gen phòng thủ ở cây bị nhiễm bệnh ở giai đoạn đầu (1 và 3 ngày sau khi xử lý (DAT), nhưng biểu hiện được tăng cường ở 7 DAT trên tất cả các thời điểm. Tuy nhiên, cây bị nhiễm P. nicotianae được xử lý tưới bằng CuO NP ở mức 100 mg L -1 đã cải thiện đáng kể biểu hiện gen ( hrs203J , NmIMSP , PR1b , P450-1 , P450-2 ) ở rễ so với nhóm không được xử lý. Sự tích lũy của các bản sao khác nhau đạt mức tối đa vào ngày thứ 5 DAT, tăng lần lượt 3,64, 4,97, 3,43, 7,71 và 50,32 lần, sau đó giảm ở ngày thứ 7 DAT, ngoại trừ gen PR1 . Đó là do gánh nặng bệnh giảm nhẹ ở cây được xử lý đã làm giảm mức độ biểu hiện của các gen phòng thủ vào cuối thí nghiệm.
Hình 7. Biểu hiện tương đối của các gen phản ứng phòng vệ ở rễ thuốc lá chưa xử lý (CK) và hạt nano đồng oxit (CuO NP) (50 và 100 mgL -1 ) được xử lý ở các khoảng thời gian khác nhau (từ 1 đến 7 ngày sau khi xử lý). A, hrs203J. B, NmIMSP. C, P450-2. D, PR1b. E, P450-1. F, hàm lượng cupper trong rễ và mô lá của cây khỏe mạnh và cây thuốc lá bị nhiễm Phytophthora nicotianae sau khi xử lý bằng hạt nano CuO. Thanh lỗi biểu thị lỗi chuẩn từ ba lần lặp lại. * và ** biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P < 0,05 và P < 0,01 giữa cây xử lý và cây đối chứng.
3.9 . Hàm lượng Cu trong lá và rễ thuốc lá
Do việc cung cấp Cu cho cây là rất quan trọng đối với việc ngăn chặn bệnh đã quan sát được, nên hàm lượng Cu trong lá và rễ của cây con thuốc lá bị nhiễm P. nicotianae và cây con thuốc lá khỏe mạnh tiếp xúc với CuO NP đã được đo. Như thể hiện trong Hình 7-F , hàm lượng Cu lớn hơn đáng kể đã được tìm thấy trong các cây bị nhiễm P. nicotianae sau khi tiếp xúc với CuO NP. Đặc biệt, nồng độ Cu ở rễ và lá tăng lần lượt là 50,03 và 27,25% sau khi xử lý 100 mg L -1 CuO NP so với đối chứng bị nhiễm, cho thấy mức Cu tích tụ cao hơn trong các cây bị bệnh. Điều thú vị là có một xu hướng rõ ràng cho thấy việc sử dụng CuO NP dẫn đến hàm lượng Cu tăng đáng kể trong rễ bị bệnh, cao gấp 1,95 và 1,85 lần so với trong lá và kết quả tương tự đã được quan sát thấy ở các mẫu khỏe mạnh khi CuO NP được sử dụng bằng cách tưới tiêu ( Hình 7-F ). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào về nồng độ Cu trong rễ hoặc lá khi tiếp xúc với NP, ngoại trừ nồng độ Cu trong rễ tiếp xúc với 100 mg L -1 CuO NP.
- Thảo luận
Trong nghiên cứu của chúng tôi, hoạt động kháng nấm của CuO NP đối với P. nicotianae cao hơn so với Aspergillusniger , Aspergillusflavus , Fusariumoxysporum , Gloeophyllumtrabeum và T. versicolor ở cùng liều lượng như đã báo cáo trước đây ( Weitz và cộng sự, 2015 ; Terzi và cộng sự, 2016 ; Devipriya và Roopan, 2017 ; Herrnida-Montero và cộng sự, 2019 ), có thể là do tác dụng đặc hiệu của các hạt nano đối với từng loài. Tuy nhiên, một số báo cáo cho thấy rằng CuO NP chỉ ức chế đáng kể sự phát triển của sợi nấm ở nồng độ 50 mg L -1 ( Hao và cộng sự, 2017 , 2019 ). Hoạt động diệt nấm mạnh tương tự của Cu NP đối với một số loại nấm gây bệnh cây trồng trong ống nghiệm đã được quan sát thấy ( Kanhed và cộng sự, 2014 ). Các đặc tính diệt bào tử trong ống nghiệm và trên cây trồng của các hạt nano kỹ thuật trên nhiều loài nấm thực vật đã được báo cáo ( Savi và cộng sự, 2013 ; Chen và cộng sự, 2016b ). Đáng chú ý, các nghiên cứu độc tính trên nhiều tác nhân gây bệnh cho thấy hoạt động độc tính tốt hơn của CuO NP so với CuO thương mại hoặc số lượng lớn, mặc dù hiệu quả phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ xử lý khác nhau và các điều kiện của các thí nghiệm ( Heinlaan và cộng sự, 2008 ). Tính ưu việt của NP này cũng đã được chứng minh đối với các hạt nano oxit kim loại khác, chẳng hạn như nano-MgO, ZnO, TiO 2 và được cho là do khả năng phân tán, kích thước và các đặc tính lý hóa của chúng ( Heinlaan và cộng sự, 2008 ; Cai và cộng sự, 2018 ).
Độc tính của nano đồng oxit CuO NP có thể bắt nguồn từ một cơ chế tương tác chung, tức là sự bám dính của các hạt nano vào tế bào nấm, tạo thành các tập hợp hạt nano-bào tử độc đáo. Điều này đã được chứng minh trong một số lượng lớn các tài liệu ( Wang và cộng sự, 2006 ; Dong và cộng sự, 2013 ; Hans và cộng sự, 2013 ; Meghana và cộng sự, 2015 ; Chen và cộng sự, 2016b ). Mishra và cộng sự (2014) đã báo cáo rằng Ag NP chịu trách nhiệm cho sự ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của bào tử của B. sorokiniana . Trong Hình 3 , một lượng lớn CuO NP và các tập hợp của chúng đã được quan sát thấy xung quanh P. nicotianae dưới kính hiển vi quang học, đặc biệt là ở nồng độ xử lý cao hơn (được chỉ ra bằng các mũi tên màu đỏ). Có khả năng các hạt nano tạo thành phức hợp với galactomannans và glycoprotein trên bề mặt của các tế bào sinh học ức chế sự hình thành bào tử của nấm ( Judelson và Blanco, 2005 ). Glycoprotein có đặc tính kết dính cố định trên tế bào nấm có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình tương tác giao diện giữa hạt nano và tế bào nấm ( Bamford và cộng sự, 2015 ). Điều quan trọng là, sự tiếp xúc trực tiếp giữa nấm gây bệnh và các hạt nano là cần thiết để gây ra tổn thương chí mạng cho thể bào tử , nơi các hạt nano bao quanh và bao phủ bào tử.
Một số lượng lớn các nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của các hạt nano đã chỉ ra rằng tổn thương hình thái tế bào có thể rất quan trọng đối với cái chết của tế bào nấm và vi khuẩn nông nghiệp ( Arciniegas-Grijalba và cộng sự, 2017 ; Cai và cộng sự, 2018 ; Chen và cộng sự, 2019 ). Mặc dù sự dày lên đồng đều của thành tế bào đã được quan sát thấy bằng kính hiển vi quang học có độ phân giải cao (HROM) khi tiếp xúc với các hạt nano, sự hóa lỏng đáng kể của các thành phần tế bào chất cũng rõ ràng và gây ra mật độ điện tử giảm ( Arciniegas-Grijalba và cộng sự, 2017 ). Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, một số hạt nano và các chất kết tụ đã được quan sát thấy trong các tế bào, có thể là do đường kính nano của các lỗ chân lông trong thành tế bào (2–3 nm) của sợi nấm và túi bào tử (2–4 nm) ( Money, 1990 ). Chỉ một hạt nhỏ duy nhất và khả năng phân tán tốt hơn có thể xâm nhập vào bào tử bằng cách xuyên qua thành tế bào. Do đó, rất khó để phân biệt các hạt nano CuO trong tế bào bằng TEM. Chúng tôi suy đoán rằng các hạt nano CuO hấp phụ đã làm tăng đáng kể tính thấm màng của nấm thông qua cùng một cơ chế tương tác mà chúng tương tác với vi khuẩn ( Meghanga và cộng sự, 2015 ; Chen và cộng sự, 2019 ). Có khả năng các hạt nano kim loại hoạt động bằng cách phá vỡ nhiều con đường, bao gồm cả việc làm hỏng thành tế bào vi khuẩn và gây ra căng thẳng oxy hóa nội bào, cũng như bằng cách tương tác với các phân tử nhỏ, một số trong số đó đã được xác minh trong các nghiên cứu tiếp theo.
Ngoài ra, một số enzyme ứng suất khác chủ yếu tham gia vào phản ứng ứng suất ( Kumari và cộng sự, 2019 ). Người ta đã đề xuất rằng P. nicotianae tiếp xúc với nồng độ hạt nano cao hơn cho thấy sự gia tăng tạo ra ROS, do đó dẫn đến tổn thương nghiêm trọng hơn đối với một loạt các con đường sinh học tế bào trong tế bào nấm, bao gồm quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào và tổn thương oxy hóa protein và axit nucleic ( Leung và cộng sự, 2014 ; Herrnida-Montero và cộng sự, 2019 ). Kết quả của chúng tôi phù hợp với các kết quả thu được trước đây, trong đó biểu hiện của các gen ứng suất trong Sclerotiniahomoeocarpa được thúc đẩy bởi Ag NP ( Li và cộng sự, 2017 ). Các enzyme khác liên quan đến quá trình tổng hợp thành tế bào, chẳng hạn như N -acetylglucosamine và β -1,3-D-glucan synthase (FKs1p), không hoạt động, mặc dù cơ chế này có thể là do tác động của sắt kim loại hòa tan bị rò rỉ từ các hạt nano.
Kết quả tương tự đã được quan sát thấy với cây cà chua ( Lycopersiconesculentum ) chống lại Phytophthorainfestans khi sử dụng nano đồng oxit CuO NP và các vật liệu nano gốc đồng khác (Cu2O NP và hợp chất Cu/Cu2O ) trên lá trong điều kiện đồng ruộng, ức chế hiệu quả sự nhiễm trùng P. infestans trên lá cà chua ( Giannousi et al. 2013 ). Hơn nữa, Cu NP và CuO NP ức chế đáng kể bệnh héo rũ do nấm Fusarium , bệnh héo rũ do nấm Verticillium và bệnh héo rũ do vi khuẩn ở các loài rau trong cả nghiên cứu trong nhà kính và ngoài đồng ruộng sau khi sử dụng trên lá ( Elmer và White 2016 ; Borgatta et al. 2018 ; Chen et al. 2019 ), trong khi nanocomposite gốc cupper thể hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh chống lại các tác nhân gây bệnh thực vật ( Antonoglou et al. 2018 ; Young et al. 2018 ), có thể được coi là tác nhân chống nấm hiệu quả và bền vững để quản lý bệnh do vi khuẩn và nấm ở thực vật . Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về việc tưới rễ bằng hạt nano. Đáng chú ý nhất là vì P. nicotianae hiện diện trong đất rễ hoặc vùng rễ , và các hạt nano được sử dụng để xử lý đất trong nghiên cứu này, nên các hạt nano đồng oxit CuO và mầm bệnh đã cho thấy sự tiếp xúc trực tiếp nhất định (sợi nấm hoặc bào tử) để phát huy tác dụng kháng nấm vượt trội. Do đó, xét từ góc độ này, tưới rễ có thể hiệu quả hơn so với bón lá trong việc chống lại mầm bệnh. Ngoài ra, cần lưu ý rằng hình thái hạt, phương pháp bón và thời gian xử lý được coi là những yếu tố quan trọng trong việc đánh giá độc tính in vitro của hạt nano và điều trị bệnh invivo ( Ingle và Rai 2017 ; Borgatta và cộng sự 2018 ).
Cây trồng sử dụng các chiến lược toàn diện để tăng cường khả năng chịu đựng của chúng dưới áp lực phi sinh học và sinh học , bao gồm các thay đổi về cấu trúc và lý sinh hóa. Phát hiện của chúng tôi cho thấy hoạt động của enzyme chống oxy hóa trong mô thực vật được cải thiện sau khi xử lý bằng CuO NP, có thể là để loại bỏ ROS tích tụ quá mức do phản ứng sinh hóa do nhiễm mầm bệnh gây ra ( Shen và cộng sự, 2020 ). Tương tự như vậy, sự điều hòa tăng các gen chống oxy hóa liên quan đến phòng thủ đã được quan sát thấy ở rễ cây bị nhiễm Fusarium được xử lý bằng vật liệu nano gốc Cu (NM) (Z hao và cộng sự, 2017 ; Elmer và cộng sự, 2018 ; Ma và cộng sự, 2019 ). Một nghiên cứu khác đã chứng minh rằng hàm lượng PAL và POD trong rễ thường được kích hoạt bởi cùng một vật liệu nano đồng và do đó làm tăng khả năng chịu đựng của cà chua, đậu lăng và kê đối với các tác nhân gây bệnh nấm ( Sathiyabama và Manikandan, 2018 ; Shen và cộng sự, 2020 ). Ngoài các loại cây trồng được trồng trên đất đã đề cập ở trên, ở các loại cây trồng thủy canh, nồng độ các chất chuyển hóa có và không có enzym cần thiết cho hệ thống phòng vệ của cây trồng đã được kích thích bởi Cu NP và do đó cải thiện khả năng chống lại C. michiganensis của các loại cây này ( Cumplido-Najera và cộng sự, 2019 ). Các con đường truyền tín hiệu kháng thuốc được kích hoạt bởi vật liệu nano cũng thể hiện rõ khi cây trồng bị nhiễm vi khuẩn ( Imada và cộng sự, 2016 ).
Tuy nhiên, có một số phát hiện trái ngược nhau cho thấy việc bón nano đồng oxit CuO NP và Si NP qua lá làm giảm phản ứng của bệnh bằng cách giảm hoạt động POD và PPO của rễ và thân hoặc giảm biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng phòng vệ của cây, cuối cùng là tăng cường phản ứng bệnh bẩm sinh của cây trồng ( Buchman và cộng sự, 2019 ; Ma và cộng sự, 2020 ). Những khác biệt này có thể là do loài thực vật, giai đoạn sinh trưởng, nồng độ hạt nano, hình thái, thành phần và quan trọng nhất là phương pháp bón. Trái ngược với phương pháp xử lý qua lá trong hầu hết các nghiên cứu, trong nghiên cứu này, rễ cây thuốc lá tiếp xúc trực tiếp với CuO NP và hấp thụ các nguyên tố đồng, dưới dạng ion đồng hòa tan hoặc dưới dạng hạt nano nguyên vẹn. Có lý khi cho rằng việc bón CuO NP vào rễ làm tăng độ nhạy cảm của cây đối với stress Cu và khả năng cung cấp Cu so với phun qua lá vì dịch tiết từ rễ , chẳng hạn như axit hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, có thể ức chế sự kết tụ và tạo điều kiện cho sự hòa tan của CuO NP ( Peng et al. 2019 ), do đó tạo điều kiện cho việc tạo ra khả năng miễn dịch của thực vật (tăng cường các enzym chống oxy hóa) trong thuốc lá để giảm thiểu ROS do nhiễm trùng mầm bệnh tạo ra.
Trong nghiên cứu này, ứng dụng của nano đồng oxit CuO NP đã kích hoạt hệ thống miễn dịch của thuốc lá bằng cách tăng cường cơ chế phòng vệ thông qua điều chỉnh các gen liên quan đến khả năng kháng thuốc này. Phiên mã cải thiện của protein PR-1, hrs203J và NmIMSP cho thấy rằng CuO NP đã kích hoạt phản ứng phòng vệ của axit salicylic (SA) hoặc kích thích phản ứng quá mẫn của thực vật để đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, dẫn đến giảm tỷ lệ mắc bệnh chồi đen trong các thí nghiệm trong chậu ( Hình 6-A ) ( Silva và cộng sự, 2013 ). P450 là các oxidase đa chức năng tồn tại rộng rãi trong thực vật và có thể tham gia vào quá trình tổng hợp nhiều chất kháng bệnh khác nhau ở thực vật thông qua nhiều con đường chuyển hóa khác nhau, chẳng hạn như độc tố, thuốc diệt khuẩn và tín hiệu căng thẳng, để kích hoạt khả năng kháng bệnh của thực vật ( Glawischnig, 2006 ; Koo và cộng sự, 2011 ). Mức độ phiên mã của gen đã thay đổi, thể hiện sự khác biệt vào những ngày khác nhau trong thí nghiệm này vì biểu hiện gen ở thực vật phụ thuộc vào thời gian xử lý, giai đoạn vòng đời của cây và thời gian nhiễm mầm bệnh ( Ma et al. 2019 ). Những phản ứng phòng vệ tích cực này khiến việc ứng dụng vật liệu nano trở thành một chiến lược hiệu quả để kiểm soát bệnh thực vật .
Ngoài ra, chúng tôi phát hiện ra rằng Cu chủ yếu tích tụ ở rễ và được đưa đến lá. Sự sẵn có của Cu trong rễ cây được coi là động lực mạnh mẽ của các phản ứng phòng vệ chống lại nhiễm nấm ( Shang và cộng sự, 2020 ). Có lý khi suy đoán rằng nồng độ Cu cao trong thuốc lá bị nhiễm bệnh có thể là nguyên nhân gây ra hoạt động tăng cao của các enzym chống oxy hóa. Người ta đã chứng minh rằng việc sử dụng nano đồng oxit CuO NP kích hoạt phản ứng khử bổ sung của cây chống lại sự can thiệp của tác nhân gây bệnh, điều này có nghĩa là khả năng hấp thụ và vận chuyển các nguyên tố dinh dưỡng của rễ cực kỳ cao sau khi P. nicotianae tấn công cây thuốc lá, do đó dẫn đến hàm lượng Cu trong mô tăng lên ngay cả khi bổ sung đồng ở liều thấp. Một lý do khác cho kết quả này liên quan đến khả năng tuyệt vời của CuO NP trong việc giải phóng các ion đồng, đặc biệt là thông qua việc bổ sung vào đất, do một loạt các dịch tiết ra từ rễ cây do nhiễm trùng tác nhân gây bệnh tạo ra, có thể hòa tan các hạt nano một cách có lợi và tăng cường đáng kể khả năng hấp phụ của chúng bởi cây trồng ( Peng và cộng sự, 2019 ). Đồng là một nguyên tố vi lượng đóng vai trò là yếu tố thiết yếu trong hầu hết các loại thực vật hiếu khí và là nguyên tố không thể thiếu trong nhiều loại protein Cu , tham gia vào quá trình vận chuyển electron quang hợp và phản ứng bảo vệ của vật chủ ( Cohu và cộng sự, 2009 ; Chmielowska và cộng sự, 2010 ). Việc ức chế bệnh ở thực vật và thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật có liên quan đến việc xử lý CuO NP trên lá hoặc đất dưới dạng phân bón nano thông qua việc điều chỉnh trạng thái dinh dưỡng và phytohormone ở thực vật ( Ma và cộng sự, 2020 ; Perez và cộng sự, 2020 ; Shang và cộng sự, 2020 ). Tuy nhiên, trong trường hợp của thực vật khỏe mạnh, hàm lượng Cu trong tất cả các mô của thực vật được xử lý bằng CuO NP vẫn không thay đổi về mặt thống kê so với các mẫu không được xử lý.
Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên về cơ chế ức chế nhiễm nấm P. nicotianae ở cây thuốc lá của hạt nano CuO. Như được chỉ ra trong Hình 8 , trong nghiên cứu này, hạt nano đồng oxitCuO có thể được sử dụng như một tác nhân kích thích nano thông qua tưới tiêu rễ và là một loại thuốc diệt nấm hiệu quả chống lại nấm gây bệnh P. nicotianae . Thông tin này rất quan trọng để hiểu rõ lợi ích của việc sử dụng hạt nano đồng oxit CuO trong nông nghiệp bền vững. Cần có thêm các nghiên cứu để hình dung chính xác vị trí của hạt nano trong mô thực vật và đánh giá khả năng ức chế bệnh của hạt nano CuO trong điều kiện đồng ruộng cũng như sự tồn tại của chúng trong môi trường.
Hình 8. Sơ đồ tóm tắt về cơ chế diệt nấm của các hạt nano oxit đồng (CuO NP) chống lại mầm bệnh Phytophthora nicotianae trong ống nghiệm và hiệu quả kiểm soát bệnh cháy đen thuốc lá (TBS) trong nghiên cứu nhà kính.
- Kết luận
Tóm lại, nghiên cứu này trước tiên nhằm mục đích trình bày các đặc tính của CuO NP như thuốc diệt nấm nano và chất kích thích phản ứng kháng thuốc của thực vật đối với P. nicotianae , tác nhân gây bệnh thối gốc ở thuốc lá. Hoạt động diệt nấm đáp ứng liều trong ống nghiệm do nano đồng oxit CuO NP gây ra đối với P. nicotianae đã được nghiên cứu, được đo bằng sự phát triển sinh sản của nấm, bao gồm sự phát triển của sợi nấm, nảy mầm bào tử và hình thành túi bào tử. Tổn thương hình thái quan sát được bằng SEM và TEM chỉ ra một cơ chế gây độc bổ sung, được cho là do sự tương tác trực tiếp giữa các hạt nano và nấm. Ngoài ra, tỷ lệ mắc TBS giảm sau khi tưới bằng CuO NP mà không gây ra tác dụng phụ đã được quan sát thấy trong một nghiên cứu trong nhà kính. Ngoài ra, hàm lượng Cu tăng lên đã được quan sát thấy ở cả cây khỏe mạnh và cây bị nhiễm P. nicotianae so với cây không được xử lý, được cho là do hoạt động enzyme tăng cường do NP gây ra và biểu hiện của các gen phản ứng phòng vệ ở thuốc lá. Những cuộc điều tra có hệ thống này cung cấp cái nhìn sâu sắc về hành vi môi trường của CuO NP đối với nấm đất nông nghiệp và hiểu biết sâu sắc để phát triển thuốc diệt nấm thay thế hiệu quả, có công nghệ nano chống lại nấm gây bệnh thực vật đất .