Astaxanthin giúp làm tăng khả năng chống chịu stress thể chất ở tôm sú con
Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định xem liệu việc tăng hàm lượng astaxanthin trong cơ thể thông qua việc bổ sung chế độ ăn ở tôm sú Penaeus monodon non có thể tăng cường khả năng chống oxy hóa và khả năng chống lại stress nhiệt và áp suất thẩm thấu hay không. Tổng trạng thái chống oxy hóa trong máu (TAS) và superoxide dismutase (SOD) được chọn làm chỉ số về khả năng chống oxy hóa của tôm. Khả năng chống lại stress nhiệt và áp suất thẩm thấu được thể hiện qua khả năng phục hồi của tôm và aspartate aminotransferase tan máu (AST) và alanine aminotransferase (ALT). Tôm sú sau 5 ngày được cho ăn khẩu phần bổ sung 0 hoặc 80 mg astaxanthin/kg trong 8 tuần để tôm con có được hai mức astaxanthin. Sau đó, tôm phải chịu sự thay đổi nhanh chóng về nhiệt độ nước (27 đến 5o C) và/hoặc độ mặn (32 ‰ đến 0 ‰) trong 5 phút. Tôm được xử lý có hàm lượng astaxanthin trong cơ thể cao hơn rõ rệt so với tôm đối chứng. Tỷ lệ thu hồi trung bình ở tôm được xử lý (56%) cao hơn đáng kể so với tôm đối chứng (48%) cho thấy rằng bổ sung astaxanthin đã cải thiện khả năng chống lại stress nhiệt và thẩm thấu. Căng thẳng nhiệt có ảnh hưởng sâu sắc hơn căng thẳng thẩm thấu đến khả năng phục hồi của tôm, được biểu thị bằng sự khác biệt về khả năng phục hồi, 73% so với 24%. TAS đã được cải thiện và SOD đã giảm nhờ sự hiện diện của astaxanthin trong chế độ ăn uống. Việc nâng cao khả năng chống oxy hóa bằng astaxanthin trong khẩu phần ăn và do đó, cải thiện khả năng phục hồi trước áp lực nhiệt và thẩm thấu đã chứng minh rằng astaxanthin là chất dinh dưỡng ‘bán thiết yếu’ cho tôm sú. Sự hiện diện của astaxanthin có thể trở nên quan trọng khi động vật bị căng thẳng sinh lý do những thay đổi phi sinh học gây ra. Tuy nhiên, người ta đã quan sát thấy những tương tác phức tạp giữa áp lực nhiệt và áp suất thẩm thấu cũng như sự cải thiện sức đề kháng do astaxanthin trong chế độ ăn mang lại. Chức năng gan tụy của tôm có thể đã được cải thiện nhờ astaxanthin trong chế độ ăn uống vì AST tan máu của tôm đối chứng cao hơn đáng kể so với tôm được điều trị. Tuy nhiên, hàm lượng AST và ALT tan máu của tôm không phản ánh sự cải thiện về sức khỏe sau các áp lực nhiệt và thẩm thấu tương ứng.
Giới thiệu
Trong khi một sinh vật phải chịu các áp lực như hóa học, vật lý, sinh học (tức là nhiễm mầm bệnh) do thiếu oxy đột ngột, các phản ứng oxy hóa bất thường trong quá trình trao đổi chất hiếu khí dẫn đến sự hình thành lượng oxy nhóm đơn dư thừa (Ranby và Rabek, 1978) và các gốc tự do được tạo ra sau đó (đôi khi được gọi là ”gốc tự do”). Những gốc này có thể làm suy yếu lipid, protein, carbohydrate và nucleotide (Yu, 1994), là những phần quan trọng của thành phần tế bào, bao gồm màng, enzyme và DNA. Thiệt hại triệt để có thể rất đáng kể vì nó có thể diễn ra như một phản ứng dây chuyền. Do đó, tỷ lệ chết có thể xảy ra do sự phá hủy nghiêm trọng bởi các gốc tự do lớn được tạo ra từ những căng thẳng cấp tính hoặc căng thẳng mãn tính lâu dài. Các chất xuất hiện tự nhiên giúp trung hòa các tác động xấu tiềm ẩn của oxy nhóm đơn và các gốc tự do thường được nhóm lại thành hệ thống phòng thủ chống oxy hóa (Yu, 1994).
Carotenoid đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe động vật như chất chống oxy hóa thông qua việc vô hiệu hóa các gốc tự do được tạo ra từ hoạt động bình thường của tế bào và các tác nhân gây căng thẳng khác nhau (Chew, 1995). h-Carotene được công nhận là chất chống oxy hóa lipid, tức là bẫy gốc tự do và khử oxy nhóm đơn. Tác dụng bảo vệ lipid của h-carotene bổ sung cho tác dụng của a-tocopherol, tùy thuộc vào hàm lượng oxy trong mô (Bohm và cộng sự, 1997). Astaxanthin chứa hệ thống liên kết đôi dài với quỹ đạo điện tử tương đối không ổn định; nó có thể loại bỏ các gốc oxy trong tế bào (Stanier và cộng sự, 1971). Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin được phát hiện là mạnh hơn h-carotene khoảng 10 lần và lớn hơn a-tocopherol 100 lần (Shimidzu et al., 1996). Astaxanthin cũng cho thấy hoạt động mạnh mẽ như một chất ức chế quá trình peroxid hóa lipid qua trung gian của các dạng oxy hoạt động và được đề xuất là “siêu vitamin E” (Miki, 1991).
Trong số các chức năng của astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản theo đề xuất của Torrissen (1990) và Shimidzu et al. (1996), đặc tính chống oxy hóa có thể liên quan chặt chẽ đến khả năng chống stress. Astaxanthin có thể giúp tăng tỷ lệ sống của tôm trong quá trình nuôi. Chiến và Jeng (1992) đã báo cáo mối tương quan tích cực giữa nồng độ sắc tố trong mô của tôm kuruma Marsupenaeus japonicus và tỷ lệ sống. Thongrod và cộng sự. (1995) cũng phát hiện ra rằng tỷ lệ sống của hậu ấu trùng tôm sú tăng lên thông qua việc bổ sung astaxanthin vào khẩu phần ăn. Việc nâng cao khả năng chống chịu stress độ mặn ở hậu ấu trùng tôm penaeid có liên quan đến sự gia tăng astaxanthin trong khẩu phần ăn và cơ thể (Darachai et al., 1998; Mercchie et al., 1998).
Trong cả hai nghiên cứu, sau 1 – 2 giờ tiếp xúc với stress giảm 27 lần độ mặn, hậu ấu trùng duy trì chế độ ăn có bổ sung hàm lượng astaxanthin cao có tỷ lệ sống sót hoặc thời gian sống tốt hơn so với những khẩu phần ăn có ít hoặc không bổ sung astaxanthin. Bên cạnh căng thẳng thẩm thấu, Chiến et al. (1999) đã chứng minh rằng dưới áp lực của stress suy giảm oxy (DO < 1 mg/l trong 4 giờ), tôm sú con được cho ăn chế độ ăn có hàm lượng astaxanthin cao có tỷ lệ sống cao hơn so với động vật đối chứng. Trong những nghiên cứu đó, mối quan hệ chặt chẽ giữa đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin và khả năng chống stress được biểu thị bằng sự gia tăng tỷ lệ sống của tôm. Không có bằng chứng sinh hóa nào được cung cấp.
Tổng trạng thái chống oxy hóa (TAS) là một chỉ số tổng thể về tình trạng chống oxy hóa của một cá nhân. Khi giá trị tăng lên, khả năng chống oxy hóa chống lại phản ứng gốc tự do cũng tăng lên. TAS thường được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng và dược phẩm, đóng vai trò là phương pháp có giá trị và có thể tái sử dụng để phát hiện tình trạng chống oxy hóa thực tế ở người (Lantos et al., 1997). Tuy nhiên, việc phát hiện nó ở cá chỉ giới hạn ở một đánh giá về tác động của các nguồn protein khác nhau trong chế độ ăn uống đối với phản ứng miễn dịch tế bào và thể dịch (Tulli et al., 2000). Không sử dụng ở động vật giáp xác đã được mô tả.
Superoxide dismutase (SOD), một enzyme tế bào đặc hiệu để loại bỏ các gốc superoxide, có liên quan đến các cơ chế bảo vệ trong tổn thương mô sau quá trình oxy hóa và thực bào. Giá trị SOD càng cao thì càng có nhiều gốc superoxide cần được phản ứng. SOD đã được sử dụng rộng rãi ở cá có vây liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, tăng cường sức khỏe, theo dõi căng thẳng ô nhiễm, tác dụng của thuốc trừ sâu, dấu hiệu bệnh và stress nhiệt hoặc thẩm thấu. Tuy nhiên, nghiên cứu về SOD ở động vật giáp xác rất hiếm (Bell và Smith, 1993; Holmblad và Soderhall, 1999; Munoz và cộng sự, 2000; Neves và cộng sự, 2000). Aspartate aminotransferase (AST) hoặc glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) và alanine aminotransferase (ALT) hoặc glutamate pyruvate transaminase (GPT) là các enzyme liên quan đến việc chuyển các nhóm amin từ axit amin cụ thể này sang axit amin cụ thể khác.
Do đó, giá trị cao hơn cho thấy sự chuyển giao các nhóm amin nhiều hơn hoặc sự lãng phí chuyển hóa axit amin trong mô nhiều hơn. Hoạt động AST và ALT thường được sử dụng làm chỉ số chung về hoạt động của gan động vật có xương sống. Nói chung, AST và ALT cao, nhưng không dứt khoát, cho thấy chức năng gan bình thường bị suy yếu hoặc bị tổn thương. AST và ALT có thể liên quan gián tiếp đến các chất chuyển hóa oxy hóa nên chúng đóng vai trò là chỉ số về tình trạng oxy hóa. Đối với cá có vây, AST và/hoặc ALT đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu đánh giá phản ứng của cá có vây với độc tố (chất ô nhiễm kim loại nặng và thuốc trừ sâu), căng thẳng do thay đổi nhiệt độ, lượng oxy thấp, nạn đói, pH, amoniac và nitrit, bệnh tật, sức khỏe, theo dõi điều trị và dinh dưỡng. Gan tụy của loài giáp xác được cho là tương đồng với gan và tuyến tụy của động vật có vú (Gibson và Barker, 1979) và chịu trách nhiệm cho các sự kiện trao đổi chất chính, bao gồm bài tiết enzyme, hấp thu và lưu trữ chất dinh dưỡng, lột xác và hình thành vitellogen (Chanson và Spray, 1992).
Một số aminotransferase trong các mô và cơ quan khác nhau bao gồm gan tụy của động vật giáp xác đã được nghiên cứu, bao gồm AST và ALT ở tôm hùm Homarus americanus (Devereaux, 1986), kynurenine aminotransferase ở tôm sú (Meunpol et al., 1998), và D-alanine oxidase và D-aspartate oxidase ở một số loài giáp xác (D’Aniello và Giuditta, 1980). Đối với động vật giáp xác, AST và ALT chỉ được sử dụng gần đây để nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trừ sâu (Galindo-Reyes và cộng sự, 2000) và ô nhiễm kim loại nặng (Zhao và cộng sự, 1995; Li và cộng sự, 1998). Nghiên cứu này có lẽ là nỗ lực đầu tiên nhằm liên hệ AST và ALT với khả năng chống lại stress ở động vật không xương sống.
Các nghiên cứu về việc bảo vệ chất chống oxy hóa chống lại tổn thương do oxy hóa có thể được tiến hành bằng cách xử lý trước động vật bằng chất chống oxy hóa, sau đó cho chúng chịu stress oxy hóa do chất oxy hóa hoặc chất độc hại gây ra (Shaikh và cộng sự, 1999). Mục tiêu của nghiên cứu này là kiểm tra tác dụng của astaxanthin như một chất chống oxy hóa ở tôm sú giống được biểu thị bằng các giá trị TAS và SOD cũng như phản ứng của tôm về khả năng phục hồi, AST và ALT đối với stress nhiệt và thẩm thấu.
Vật liệu và phương pháp
2.1. Nuôi dưỡng
Hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) 5 ngày tuổi, có trọng lượng trung bình 6,7 ± 1 mg, được nuôi trong nhà trong 2 bể polyetylen gia cố bằng sợi thủy tinh nặng 0,5 tấn với mật độ 500 con/bể. Các bể chứa được phủ màn đen để ngăn chặn sự phát triển của tảo. Tôm được cho ăn một trong hai chế độ ăn (Bảng 1) chứa 0 hoặc 80 mg astaxanthin/kg thức ăn ở mức 5% trọng lượng cơ thể mỗi ngày vào lúc 08:00, 16:00 và 20:00 h. Các mảnh vụn ở đáy bể được loại bỏ bằng siphon hàng ngày và khoảng 1/3 lượng nước được thay thế hàng ngày bằng nước biển khử trùng bằng tia cực tím và lọc 1-µm. Chất lượng nước duy trì tương đối ổn định: 27 –29 oC, độ mặn 30 –32‰, pH 8,2 –8,3 và DO 5,2 –6,5 mg/l. Amoniac-N và nitrit-N được theo dõi và giữ ở mức an toàn (Chiến, 1992). Thời gian cho ăn là 8 tuần. Trọng lượng tôm cuối cùng và tỷ lệ sống được ghi lại. Trước và sau khi nuôi, hàm lượng astaxanthin của 5 con trong mỗi bể được phân tích.
Bảng 1 Thành phần (g/kg) và phân tích gần đúng của khẩu phần thí nghiệm
2.2. Phân tích nồng độ astaxanthin trong mô tôm toàn thân
Tôm được cân, đông khô và cân lại để xác định độ ẩm. Sau đó, mẫu khô được nghiền bằng cối sứ và chày rồi cho vào ống ly tâm polypropylen 50 ml. Sau đó, 20 ml axeton (0,05% butylat hydroxytoluene, BHT) được thêm vào làm dung môi (Schwartz và Patroni-Killam, 1985; Khachik et al., 1986; Barimalaa và Gordon, 1988), và hỗn hợp được đồng nhất hóa (Polytron PT-MR3000) với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút. Nội dung của mỗi ống được ly tâm (Hitachi 18 PR52) dưới 4 oC ở mức 12.700 g trong 15 phút. Các viên được tạo huyền phù lại và ly tâm với 20 ml axeton bổ sung cho đến khi dịch chiết axeton trong suốt. Dịch chiết axeton gộp lại được chuyển sang phễu tách 250 ml, được phân chia bằng 30 ml nhexane, được rửa ba lần bằng NaCl 10% để loại bỏ axeton dư. Thể tích dịch chiết được giảm xuống còn 10 ml bằng thiết bị bay hơi quay và sau đó được lọc qua bộ lọc Millipore 0,2-µm và bảo quản trong 3 lọ 4 ml màu nâu. Astaxanthin được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sử dụng bơm Hitachi L-6200, cột silica (cột Lichrosorb Si-60 5 micro 2504,6 mm ID, E. Merck), máy dò Hitachi L-4250 UV –VIS ở bước sóng 470 nm và Bộ tích hợp sắc ký Hitachi D-2000. Các điều kiện hoạt động là: pha động, 14% axeton trong nhexan; tốc độ dòng dung môi, 1,5 ml/phút; thể tích tiêm, 100 Al; và chương trình bơm, trình tự là 0–20 phút Hỗn hợp A và 20,5–40 phút Hỗn hợp B; Hỗn hợp A là axeton: n-hexan, 14:86, và Hỗn hợp B là n-heptan 100%. Hệ thống này được điều khiển bởi hệ thống dữ liệu sắc ký (Dịch vụ thông tin khoa học), hệ thống này cũng tích hợp các vùng dưới các pic. Chất chuẩn là astaxanthin tinh khiết về mặt sắc ký, một món quà từ Hoffman La Roche, Basel, Thụy Sĩ. Astaxanthin trong cơ thể được biểu hiện trên cơ sở trọng lượng khô để loại bỏ lỗi tiềm ẩn do sự thay đổi độ ẩm của tôm liên quan đến các giai đoạn khác nhau của chu kỳ lột xác (Pan và cộng sự, 1999).
2.3. Kiểm tra căng thẳng
Tôm từ mỗi lần xử lý bằng astaxanthin được thu thập, phân vào 12 cốc 2000 ml với mật độ 25 con/cốc và thích nghi với nhiệt độ 27 0C và độ mặn 32‰ trong 24 giờ. Tất cả 24 cốc đều được sục khí liên tục và không được cho ăn. Bốn bể nước được kiểm soát nhiệt độ đã được cài đặt trước ở một trong hai mức nhiệt độ và chứa một trong hai độ mặn của nước để tạo thành bốn chế độ nhiệt độ – độ mặn: (1) không có căng thẳng ở mức kiểm soát, 27 0C và độ mặn 32‰; (2) chỉ áp suất thẩm thấu, 27 0 C và độ mặn 0‰; (3) chỉ ứng suất nhiệt, 5 0C và độ mặn 32‰; và (4) cả ứng suất thẩm thấu và nhiệt, 5 0C và độ mặn 0‰. Khi hết thời gian thích nghi, một hoặc hai con tôm chết trong vài cốc. Một thử nghiệm t không ghép đôi (n = 12) cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ tử vong giữa tôm đối chứng và tôm được điều trị. Để số lượng tôm trong mỗi đơn vị thí nghiệm bằng nhau và để dễ tính toán độ thu hồi, 20 con tôm đang hoạt động từ mỗi cốc đã được thử nghiệm dưới áp lực. Chúng được thu thập bằng một chiếc lưới cầm tay nhỏ và ngay lập tức nhúng vào bể có áp suất được chỉ định trong 5 phút, sau đó đưa trở lại cốc ban đầu. Nước biển 27 0C và 32‰ được cho vào mỗi cốc trong khi tôm được trả lại. Sự phục hồi, được định nghĩa là tỷ lệ giữa số lượng tôm tiếp tục bơi bình thường với số lượng tôm được kiểm tra, được ghi nhận 24 giờ sau khi quay trở lại. Việc tiếp xúc với từng điều kiện căng thẳng được lặp lại ba lần (cốc tôm). Quy trình này được thực hiện để kiểm soát và xử lý tôm.
2.4. Sinh hóa máu huyết
Máu huyết của tôm sau stress được rút ra bằng cách đâm một cây kim vào khoang màng ngoài tim qua màng xen kẽ giữa phần đầu ngực và phần bụng. Các mẫu tan máu được chuẩn bị bằng cách trộn dung dịch NaCl đẳng trương 400 Al chứa 0,94 m mol/l EDTA với 100 Al tan máu ngay sau khi rút tan máu. Các mẫu được làm lạnh nếu không được sử dụng ngay để xác định TAS, SOD, AST, ALT và protein tan máu.
2.4.1. TAS và SOD
Để đo TAS và SOD tan máu, lần lượt 20 và 25 Al của mẫu tan máu đã được sử dụng và xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 600 và 505nm, tương ứng với máy quang phổ U-2000 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) ở 37o C. Tất cả các xét nghiệm được thực hiện trong vòng 5 giờ sau khi lấy mẫu bằng bộ dụng cụ của Phòng thí nghiệm Randox (Crumlin, Antrim, UK) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoạt động được biểu thị bằng đơn vị enzyme quốc tế (Ul 1).
2.4.2. AST và ALT
Hoạt tính AST và ALT được xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 340 nm bằng máy quang phổ U2000 (Hitachi) ở 37o C. Mỗi mẫu sử dụng 100 mẫu bạch huyết Al. Tất cả các xét nghiệm được thực hiện trong vòng 5 giờ sau khi lấy mẫu bằng bộ dụng cụ của Phòng thí nghiệm Randox theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoạt động được biểu thị bằng đơn vị enzyme quốc tế (Ul 1).
2.4.3. Protein tan máu
Protein tan máu được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein (số 500-0006, phòng thí nghiệm Bio-rad, Richmond, CA, USA) và albumin huyết thanh bò (BSA, 66 kDa, Sigma) làm tiêu chuẩn, một phương pháp có nguồn gốc từ Bradford (1976 ). Một phân tích đã sử dụng mẫu tan máu 200-Al.
2.5. Phân tích thống kê
Đối với thử nghiệm stress nhiệt và thẩm thấu, ANOVA 2´2´2 3 chiều đã được sử dụng để xác định ảnh hưởng của astaxanthin trong cơ thể tôm, stress nhiệt độ và stress độ mặn đối với khả năng phục hồi và các thông số sinh hóa của tôm. Vì dữ liệu phục hồi được biểu thị bằng phần trăm nên phép biến đổi căn bậc hai arcsine đã được thực hiện trước khi phân tích (Sokal và Rohlf, 1995; Ray và cộng sự, 1996).
Kết quả
Trong trường hợp không lặp lại, không thể thực hiện kiểm tra thống kê để so sánh mức tăng trưởng (Bảng 2). Sau 8 tuần nuôi cấy, con vật đã tăng trưởng hơn 50.000%. Nếu không bổ sung chế độ ăn uống, nồng độ astaxanthin trong cơ thể ở tôm đối chứng sau khi nuôi chỉ xấp xỉ 17% nồng độ trước khi nuôi. Sau khi nuôi, nồng độ astaxanthin trong tôm được xử lý là 72% so với trước khi nuôi. Mức tăng astaxanthin trong cơ thể do bổ sung astaxanthin là 334% ((45,6 – 10,5)/10,5). Bỏ qua cả hai căng thẳng, tốc độ phục hồi trung bình ở tôm đối chứng thấp hơn đáng kể so với tôm được xử lý (Bảng 3).
Bảng 2 Tăng trưởng, tỷ lệ sống và hàm lượng astaxanthin của tôm
Bảng 3 Giá trị thu hồi trung bình (n = 12) và hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa tan máu của tôm sú đối chứng và tôm sú được xử lý sau khi chịu áp lực về nhiệt độ và độ mặn giảm
Chế độ ăn bổ sung astaxanthin ở mức 80 mg/kg đã cải thiện khả năng đề kháng của tôm đối với stress thẩm thấu 19% và chỉ riêng stress nhiệt đã 13% so với tôm đối chứng (Bảng 4). Bỏ qua tác dụng của astaxanthin trong cơ thể, khả năng phục hồi đối với stress thẩm thấu và stress nhiệt là khác nhau. Áp lực giảm nhiệt độ 22o C có tác động lớn hơn áp lực giảm độ mặn 32‰ vì tỷ lệ phục hồi trung bình của tôm lần lượt là 16% và 40%. Không có áp lực nhiệt và thẩm thấu, cả tôm đối chứng và tôm được xử lý đều có khả năng phục hồi 100% (Bảng 4). Bất kể tác dụng của astaxanthin trong cơ thể, tỷ lệ phục hồi trung bình lần lượt là 29% ((22 + 35%)/2) và 78% chỉ đối với stress nhiệt và 78% chỉ đối với stress nhiệt và stress thẩm thấu. Trong điều kiện căng thẳng kết hợp, cả tôm đối chứng và tôm được xử lý đều có mức phục hồi như nhau, 3%, khoảng 1/10 mức phục hồi của từng loại stress khi áp dụng đơn lẻ. Tôm đối chứng có khả năng phục hồi thấp hơn đáng kể so với tôm được xử lý khi tiếp xúc với stress nhiệt hoặc áp lực thẩm thấu.
Bảng 4 Giá trị trung bình (n = 3) và độ lệch chuẩn (trong ngoặc đơn) của khả năng thu hồi và hoạt tính của enzyme chống oxy hóa tan máu của tôm sú giống sau khi bị stress nhiệt độ và độ mặn giảm
Trong số các tương tác, chỉ có tác động tương tác bậc ba, stress nhiệt, độ mặn astaxanthin của cơ thể, đối với quá trình phục hồi là đáng kể (Bảng 5). Bỏ qua cả hai căng thẳng, giá trị TAS trung bình ở tôm đối chứng thấp hơn đáng kể so với tôm được xử lý (Bảng 3). TAS không bị ảnh hưởng bởi ứng suất thẩm thấu hoặc ứng suất nhiệt mà bởi sự tương tác của cả hai (Bảng 5).
Bỏ qua cả hai căng thẳng, giá trị SOD trung bình ở tôm đối chứng cao hơn đáng kể so với tôm được xử lý (Bảng 3). Bất kể tác dụng astaxanthin của cơ thể và stress nhiệt, SOD trung bình tăng 45% ((0,175 – 0,121)/0,121) trong điều kiện căng thẳng thẩm thấu. Bất kể tác dụng astaxanthin của cơ thể và stress thẩm thấu, stress nhiệt cũng làm tăng SOD trung bình lên 79%. Giá trị SOD trung bình của cả hai loài tôm không gặp bất kỳ căng thẳng nào là 0,028, xấp xỉ 17% so với giá trị được tìm thấy ở tôm chịu cả hai căng thẳng là 0,165 (Bảng 4). Các tác động tương tác đáng kể lên SOD đã được tìm thấy giữa stress nhiệt độ mặn và giữa các hiệu ứng astaxanthin trong cơ thể stress nhiệt độ mặn (Bảng 5).
Bỏ qua cả hai căng thẳng, giá trị AST trung bình ở tôm đối chứng cao hơn đáng kể so với tôm được xử lý (Bảng 3). Bất kể tác dụng astaxanthin của cơ thể và stress nhiệt, hoạt động AST giảm 19% dưới áp lực thẩm thấu. Bất kể tác dụng của astaxanthin trong cơ thể và stress thẩm thấu, có nghĩa là AST không bị ảnh hưởng bởi stress nhiệt. Trong khi chịu áp lực thẩm thấu ở cả 27 và 5o C, AST của tôm đối chứng cao hơn đáng kể so với tôm được xử lý (Bảng 4). Loại trừ áp lực thẩm thấu, không tìm thấy sự khác biệt về AST giữa tôm đối chứng và tôm được xử lý. Hiệu ứng tương tác đáng kể lên SOD đã được tìm thấy giữa stress nhiệt độ mặn và stress nhiệt (Bảng 5). Bỏ qua cả hai yếu tố căng thẳng, giá trị ALT trung bình không bị ảnh hưởng bởi astaxanthin trong cơ thể (Bảng 3). Giá trị ALT cao hơn đáng kể ở tôm đối chứng so với tôm được xử lý chỉ được tìm thấy khi tôm không bị căng thẳng (Bảng 4). Bất kể tác dụng astaxanthin của cơ thể và stress nhiệt, stress thẩm thấu không ảnh hưởng đến ALT trung bình. Bất kể tác dụng astaxanthin của cơ thể và stress thẩm thấu, ALT trung bình giảm 25% khi bị stress nhiệt. Không có hiệu ứng tương tác nào được tìm thấy trên ALT (Bảng 5).
Bảng 5 Tác dụng điều trị (A — bổ sung astaxanthin, S — giảm độ mặn và T — giảm nhiệt độ) đối với khả năng phục hồi (REC), tổng trạng thái chống oxy hóa (TAS), superoxide dismutase (SOD), aspartate transaminase (AST) và alanine transaminase (ALT)
Thảo luận
4.1. Sắc tố
Hiệu ứng pha loãng và giảm nồng độ astaxanthin trong cơ thể tôm được quan sát thấy khi tôm tăng trưởng, một tình trạng đã được báo cáo trước đây (Menasveta và cộng sự, 1993; Pan và cộng sự, 1999). Mặc dù chế độ ăn cho tôm được xử lý chứa 113% (71,5/63,2) nồng độ astaxanthin trong tôm PL5 toàn cơ thể khi bắt đầu thử nghiệm, nhưng nồng độ astaxanthin trong cơ thể của những con tôm này vẫn giảm 28% trong suốt 8 tuần thử nghiệm cho ăn. Sự giảm nồng độ astaxanthin có thể chủ yếu là do tôm tăng trọng, khoảng 50.000%. Sắc tố thu được từ nguồn thức ăn có thể khác nhau tùy theo loài, kích cỡ của động vật, tốc độ tăng trưởng, điều kiện và thời gian nuôi, mức astaxanthin trong khẩu phần, mô sắc tố và các yếu tố chưa biết khác (Pan và cộng sự, 2001), do đó, hiệu quả tạo sắc tố của nghiên cứu này khó có thể so sánh với người khác. ±
4.2. Sự hồi phục
Khả năng chống lại stress thẩm thấu đã được sử dụng để đánh giá chất lượng tôm sau ấu trùng (Tackaert và cộng sự, 1989) và tình trạng dinh dưỡng sau ấu trùng (Ree và cộng sự, 1994). Sự thay đổi độ dốc và thời gian của áp suất thẩm thấu có thể thay đổi: 15 – 20‰ và 2 h (Bauman và Scura, 1990), 20 –40xand 2 h (Dura’n Go’mez et al., 1991), 20– 30‰ và 2 h (Ree và cộng sự, 1994), 27x và 1 h (Merchie và cộng sự, 1998), và 28 ‰ and 2 h (Darachai và cộng sự, 1998).
Xét thấy rằng cá con có thể kém khỏe mạnh hơn hậu ấu trùng khi chịu sự thay đổi lớn về độ mặn, chúng tôi đã rút ngắn thời gian căng thẳng xuống còn 5 phút và sử dụng khả năng phục hồi, thay vì sống sót trong các nghiên cứu đó, làm thông số phản ứng. Việc sử dụng stress nhiệt hoặc sự kết hợp giữa stress nhiệt và thẩm thấu để phân biệt giữa hậu ấu trùng hoặc tôm non giáp xác yếu và khỏe mạnh chưa được báo cáo trước đây. Mercchie et al. (1998) và Darachai et al. (1998). Trong nghiên cứu của Mercie, hậu ấu trùng tôm sú đã phải chịu áp lực về độ mặn bao gồm việc chuyển nước có độ mặn từ 27‰ sang 0‰ trong 1 giờ.
Tôm được bổ sung 810 mg astaxanthin/kg có chỉ số stress tích lũy (Dhert và cộng sự, 1992) thấp hơn đáng kể so với tôm hậu ấu trùng được cho ăn chế độ ăn có chứa 230 mg astaxanthin/kg. Cả hai chế độ ăn đều chứa 1700 mg axit ascorbic/kg và đã được cho hậu ấu trùng ăn trong 4 tuần trước khi tiếp xúc với sốc độ mặn. Trong nghiên cứu của Darachai, hậu ấu trùng tôm sú 15 ngày được chuyển từ tốc độ 30 lần và ngâm trong nước có độ mặn gấp 2 lần trong 2 giờ. Ấu trùng được cho ăn khẩu phần bổ sung astaxanthin tổng hợp hoặc astaxanthin tảo từ zoea II cho thấy thời gian tăng lên đến 50% tỷ lệ tử vong tích lũy (37–45 phút) so với thời gian đạt tới tỷ lệ tử vong tích lũy 50% của ấu trùng được cho ăn chế độ ăn không có sắc tố (32 phút). Darachai và cộng sự. (1998) kết luận rằng astaxanthin dường như giúp kéo dài tuổi thọ của hậu ấu trùng sau khi bị căng thẳng môi trường cấp tính. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi cũng xác nhận rằng khả năng kháng stress độ mặn (32‰ đến 0‰ shock trong 5 phút) ở tôm sú giống (PL61, 3,4–3,6 g) có thể được tăng cường thông qua bổ sung astaxanthin trong chế độ ăn uống (80 mg/kg) và tăng đồng thời astaxanthin trong cơ thể ( 45,6 Ag/g). Trong các nghiên cứu trước đây (Darachai và cộng sự, 1998; Mercchie và cộng sự, 1998), động vật trẻ hơn nhiều (PL10; PL15), thời gian stress dài hơn nhiều (1 giờ; 2 giờ), phạm vi nồng độ astaxanthin trong khẩu phần ăn cũng cao hơn. rộng hơn (230 và 810 mg/kg; 0, 189 và 209 mg/kg), và nồng độ astaxanthin trong cơ thể cao hơn (117 và 165 µg/g; 97, 109 và 123 µg carotenoid/g).
Bên cạnh khả năng chống chịu stress thẩm thấu, khả năng chống chịu stress nhiệt ở tôm sú giống cũng được tăng cường nhờ bổ sung astaxanthin trong khẩu phần ăn. Tuy nhiên, trong điều kiện căng thẳng phức tạp, tôm được xử lý không cải thiện được sức đề kháng so với đối chứng. Điều này có thể là do căng thẳng tổng hợp quá mạnh và vượt quá phạm vi chịu đựng sinh lý. Hiệu ứng tích lũy của ứng suất nhiệt và thẩm thấu dường như đang hoạt động.
Mercie et al không có lời giải thích nào về việc tăng cường khả năng chống chịu stress mặn bằng astaxanthin trong khẩu phần ăn. (1998). Darachai và cộng sự. (1998) kết luận rằng astaxanthin dường như hữu ích trong việc kéo dài tuổi thọ của hậu ấu trùng tôm sú khi tiếp xúc với áp lực của độ mặn giảm. Họ suy đoán rằng sự thay đổi này đòi hỏi phải tiêu tốn nhiều năng lượng hơn để duy trì sự ổn định thẩm thấu. Trong những điều kiện này, sẽ có khả năng tạo ra lượng gốc oxy cao bất thường. Vì astaxanthin chứa hệ thống liên kết đôi dài với quỹ đạo điện tử tương đối không ổn định nên nó có thể loại bỏ các gốc oxy trong tế bào (Stanier và cộng sự, 1971) và do đó làm giảm tổn thương tế bào và tăng cường sức đề kháng. Suy đoán tương tự có thể được áp dụng cho ứng suất nhiệt vì ứng suất nhiệt cũng liên quan đến quá trình oxy hóa năng lượng.
4.3. TAS và SOD
Sự không nhất quán trong phản ứng với ứng suất nhiệt và thẩm thấu giữa TAS và SOD có thể được giải thích như sau. Do tính đặc hiệu của SOD trong việc xúc tác quá trình biến đổi O2 thành hydro peroxide, nó không có mối quan hệ nghịch đảo hoàn toàn với TAS, một chỉ số về tình trạng bảo vệ chống oxy hóa tổng thể chống lại các loại oxy phản ứng (ROS) và các chất trung gian oxy phản ứng (ROI) . Khi một sinh vật lần đầu tiên bị căng thẳng, SOD sẽ có thể phản ứng tương ứng và ngay lập tức với việc sản xuất anion superoxide. Vì TAS chỉ ra tiềm năng tĩnh của khả năng chống oxy hóa chống lại tất cả
các gốc tự do, nó có thể không có sự thay đổi rõ rệt khi bị căng thẳng nếu việc sản xuất anion superoxide không đáng kể so với các gốc đã tồn tại. TAS và SOD của bệnh tan máu tôm đã được cải thiện nhờ astaxanthin trong chế độ ăn uống và được phản ánh qua sự phục hồi quan sát được. Các chất chống oxy hóa khác nhau, chẳng hạn như vitamin C và/hoặc vitamin E (Poston và cộng sự, 1976; Watanabe và cộng sự, 1981; Bell và cộng sự, 1985; Maage và cộng sự, 1990; Wahli và cộng sự, 1998) và astaxanthin (Christiansen và cộng sự, 1995; Thompson và cộng sự, 1995), được bổ sung vào khẩu phần ăn để tăng cường sức khỏe và khả năng miễn dịch của cá có vây. Yang và cộng sự. (1995) đã sử dụng SOD để đánh giá độc tố tảo trong cá hồi vân và đề xuất rằng độc tính của thực vật phù du biển có cờ đối với cá hồi là do sự hình thành nồng độ độc hại của superoxide, gốc hydroxyl và hydro peroxide.
Sakai và cộng sự. (1998) phát hiện ra rằng SOD ở gan ở cá đuôi vàng Seriola quinqueradiata thấp hơn so với đối chứng và kết luận rằng bệnh vàng da ở cá có thể là kết quả của stress oxy hóa nghiêm trọng. Astaxanthin, có hoạt tính dập tắt 1 O2 mạnh, được cho là có vai trò bảo vệ sinh vật biển khỏi ROS (Shimidzu và cộng sự, 1996). Tuy nhiên, trong số những nghiên cứu đó, SOD hiếm khi được sử dụng như một trong những chỉ số sức khỏe. Vitamin E và astaxanthin đều là chất chống oxy hóa, nhưng tác dụng của chúng đối với các enzym oxy hóa là khác nhau. Đối với cá hồi Đại Tây Dương sau lột xác, Lygren et al. (1999) nhận thấy rằng vitamin E ảnh hưởng tiêu cực đến cả hoạt động catalase và hoạt động SOD của mô trong khi astaxanthin chỉ ảnh hưởng xấu đến hoạt động catalase. Holmblad và Soderhall (1999) lần đầu tiên liên hệ SOD với khả năng miễn dịch ở giáp xác. Họ suy đoán rằng peroxinectin và SOD ngoại bào phối hợp trong quá trình hô hấp để tiêu diệt ký sinh trùng ăn vào hoặc đóng gói.
SOD trong mang và gan của cá da trơn nước ngọt Heteropneustes hóa thạch tăng lên khi nhiệt độ tăng từ 25 đến 37o C sau 1–4 giờ (Parihar et al., 1996, 1997). SOD trong máu tăng lên ở cá chẽm châu Âu Dicentrarchus labrax khi tiếp xúc với nhiệt độ tăng (13 đến 23 jC trong 1 giờ) (Roche và Boge, 1996). Việc tăng hoặc giảm nhiệt độ đột ngột có thể dẫn đến tăng đột ngột quá trình trao đổi chất hoặc tiêu thụ oxy và đồng thời tăng SOD. Neves và cộng sự. (2000) cho rằng hoạt động SOD thấp hơn ở tôm bị nhiễm ký sinh trùng mang làm thay đổi mức tiêu thụ oxy khi hô hấp của động vật bị nhiễm ký sinh trùng bị suy yếu. Ảnh hưởng của stress thẩm thấu lên SOD của cá hiếm khi được nghiên cứu. Roche và Boge (1996) cho rằng sự gia tăng SOD trong máu của cá chẽm châu Âu khi độ mặn giảm (37xto 5xin 2 h) là do khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa tự nhiên của epinephrine, nồng độ của chất này thường tăng ở cá bị căng thẳng. Những phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng các tương tác phức tạp trên TAS và SOD tồn tại giữa stress nhiệt và áp suất thẩm thấu cũng như hiệu ứng astaxanthin của cơ thể (Bảng 5). Roche và Boge (1996) Y.-H. Chiến và cộng sự. / Nuôi trồng thủy sản 216 (2003) 177–191 187 cũng chỉ ra rằng phản ứng của các thông số trong máu cá đối với stress nhiệt và áp suất thẩm thấu là khác nhau. Trong nghiên cứu của họ, sự gia tăng hoạt động của glycemia, cortisol và peroxidase đối với stress nhiệt lớn hơn so với sốc thẩm thấu, trong khi hoạt động SOD và catalase bị kích thích nhiều hơn bởi sốc thẩm thấu.
Nguồn tham khảo: The resistance to physical stresses by Penaeus monodon juveniles fed diets supplemented with astaxanthin
Yew-Hu Chien a,*, Chih-Hung Pan a , Brian Hunter b a Department of Aquaculture, National Taiwan Ocean University, Keelung 202, Taiwan b Roche Aquaculture Centre Asia Pacific, 11/F 2535 Sukhumvit Road, Bangchak Prakanong, Bangkok 10250, Thailand