Astaxanthin kết hợp với acid formic giúp tăng khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng

Một thử nghiệm cho ăn kéo dài 90 ngày đã được tiến hành để đánh giá tác động của axit formic (FA) và astaxanthin (AX) đối với sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, các thông số miễn dịch và khả năng chống nhiễm Vibrio parahaemolyticus  ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương. Nghiên cứu được chia thành hai thí nghiệm.

Trong thí nghiệm 1, Tôm post 12 ngày tuổi được phân ngẫu nhiên thành sáu nhóm và sau đó cho ăn bốn lần mỗi ngày với sáu khẩu phần thử nghiệm chứa 0,3 % FA, 0,6 % FA, 50 ppm AX, 0,3 % FA + 50 ppm AX, 0,6 % FA + 50 ppm AX, và mẫu đối chứng (không có chất bổ sung nào trong số này). Sau 60 ngày thử nghiệm cho ăn, trọng lượng cơ thể của tất cả các nhóm điều trị không khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng, mặc dù tôm được cho ăn axit formic có trọng lượng cơ thể thấp hơn đáng kể so với tôm được cho ăn 50 ppm AX. Tuy nhiên, nhóm AX 0,6% FA + 50 ppm có tỷ lệ sống sót cao hơn đáng kể (82,33 ± 8,32%) so với nhóm đối chứng (64,33 ± 10,12%).

Trong thí nghiệm 2, Vibrio parahaemolyticus được bổ sung vào mỗi bể để đạt được nồng độ cuối cùng là 104 CFU/mL. Mỗi nhóm điều trị nhận được chế độ ăn kiêng nói trên trong 30 ngày nữa. Vào cuối thí nghiệm này, không có sự khác biệt về mức tăng cân giữa tất cả các nhóm thử nghiệm. Tuy nhiên, tỷ lệ sống của tôm có chế độ ăn bao gồm acid formic, astaxanthin và sự kết hợp của chúng (trong khoảng 45,83–67,50%) cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (20,00 ± 17,32%). Tôm được nuôi bằng FA cũng có tổng lượng vi khuẩn đường ruột và Vibrio spp thấp hơn đáng kể. trong khi các thông số miễn dịch [tổng số lượng tế bào máu (THC), hoạt động thực bào, hoạt động phenoloxidase (PO) và hoạt động superoxide dismutase (SOD)] của các nhóm được cho ăn AX được cải thiện đáng kể so với các nhóm khác. Tóm lại, Formic acid, astaxanthin và sự kết hợp của chúng rất hữu ích trong việc kích thích hệ miễn dịch của tôm để kháng lại vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

acid hữu cơ kết hợp với astaxanthin

(NANOCMM TECHNOLOGY)

phương pháp

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của axit formic và astaxanthin đến sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương.

Tôm và quy trình thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu Kinh doanh Nuôi trồng Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Kasetsart, Thái Lan. Postlarvae-9 (PL-9) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương được lấy từ trại giống ở tỉnh Chachoengsao, Thái Lan. Sau 3 ngày thích nghi, tôm (PL-12) được phân ngẫu nhiên vào các bể sợi thủy tinh 24 × 500-L (bốn bể lặp lại cho mỗi lần xử lý). Mỗi bể thả 75 con tôm. Mỗi nhóm điều trị được cho ăn một trong sáu chế độ ăn kiêng bốn lần mỗi ngày để no trong 60 ngày. Độ mặn trong suốt thí nghiệm được duy trì ở mức 25 ppt, oxy hòa tan trên 4 ppm và nhiệt độ nước ở 29 ± 1 °C. Thức ăn thừa và phân được hút hàng ngày, thay 10% lượng nước sau mỗi 3 ngày. Trọng lượng cơ thể trung bình và tỷ lệ sống của tôm được ghi nhận sau thời gian thí nghiệm 60 ngày. Mười con tôm từ mỗi bể được chọn ngẫu nhiên và cân riêng lẻ bằng cân hai chữ số thập phân.

Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của axit formic và astaxanthin đến sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, vi khuẩn đường ruột và phản ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương bị nhiễm Vibrio parahaemolyticus .

Tôm và quy trình thí nghiệm

Tôm từ mỗi bể trong thí nghiệm 1 được phân ngẫu nhiên vào các bể sợi thủy tinh 24 × 500-L mới (bốn bể lặp lại cho mỗi lần xử lý). Mật độ thả nuôi là 30 con/bể. Khi bắt đầu thí nghiệm này (0 ngày), Vibrio parahaemolyticus đã được thêm vào mỗi bể để đạt được nồng độ cuối cùng là 10 4 đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)/mL, đây là nồng độ Vibrio bình thường trong nước nuôi tôm như mô tả bởi Sung và cộng sự. ( 2001 ) và Lavilla-Pitogo và cộng sự. ( 1998 ). V. parahaemolyticus được sử dụng cho thử nghiệm thử thách ngâm trong nghiên cứu này được thu thập từ trang trại EMS ở Thái Lan bằng phương pháp được mô tả bởi Joshi et al. ( 2014 ). Mỗi nhóm điều trị nhận được chế độ ăn giống như trong thí nghiệm 1 bốn lần mỗi ngày trong 30 ngày nữa. Độ mặn, oxy hòa tan và nhiệt độ nước được duy trì như thí nghiệm 1. Thức ăn thừa và phân được hút 2 ngày một lần.

Nghiên cứu tăng trưởng và sống sót

Trọng lượng của tôm từ mỗi phương pháp điều trị được đo và tỷ lệ sống của chúng được ghi nhận vào ngày thứ 30 sau khi được thử cảm nhiễm với V. parahaemolyticus ở mức 10,4 CFU /mL.

Nghiên cứu vi khuẩn đường ruột

Năm con tôm từ mỗi nhóm được chọn ngẫu nhiên và ruột của chúng được thu thập vào ngày thứ 10, 20 và 30. Ruột của mỗi con tôm được đồng nhất và trải trên TCBS (môi trường chọn lọc nuôi cấy Vibrio spp.) hoặc NA (môi trường chung cho hầu hết nuôi cấy vi khuẩn) bằng kỹ thuật trải đĩa, sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ. Cuối cùng, tất cả các khuẩn lạc vi khuẩn được đếm và tính theo đơn vị CFU/g.

Nghiên cứu thông số miễn dịch

Các thông số miễn dịch được đo vào cuối thử nghiệm cho ăn. Mười con tôm trong mỗi đợt điều trị đã được sử dụng để xét nghiệm miễn dịch. Một mẫu máu huyết 250 µL từ mỗi con tôm được lấy từ gốc của chân bước thứ 3 bằng cách sử dụng một ống tiêm chứa 750 µL chất chống đông máu đã được làm lạnh trước (4°C) (0,114 M trisodium citrate, 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM HEPES ở pH 7,4) (Nonwachai và cộng sự 2010 ). Hỗn hợp chất chống đông máu-tán huyết được sử dụng để đo tổng số lượng tế bào máu (THC), hoạt tính thực bào, hoạt tính phenoloxidase (PO), hoạt tính superoxide dismutase (SOD) và hoạt tính diệt khuẩn.

  1. Tổng số lượng tế bào máu

Sau khi lấy máu, các tế bào máu được đếm bằng máy đo huyết cầu và được tính bằng THC (tế bào/mL) = số lượng × 104  × hệ số pha loãng.

  1. Hoạt động thực bào

Hoạt động thực bào được xác định theo Itami et al. ( 1994 ). Hồng cầu tôm thu được được rửa bằng nước muối tôm (dung dịch NaCl 28,4 g, MgCl 2 ·6H 2O 1,0 g, MgSO4·7H 2O 2,0 g, CaCl 2 ·2H 2O 2,25 g, KCl 0,7 g, glucose 1,0 g và HEPES 2,38 g/L) và số lượng tế bào sống được điều chỉnh thành 1 × 106 tế bào/mL. Huyền phù tế bào (200 µL) được cấy vào phiến kính. Sau 20 phút, loại bỏ huyền phù tế bào và rửa sạch bằng nước muối tôm ba lần. Chuẩn bị men khử nhiệt (2 mL) được thêm vào và ủ trong 2 giờ. Tiếp theo, loại bỏ chế phẩm nấm men diệt nhiệt và rửa huyền phù tế bào bằng nước muối tôm 5 lần để đạt nồng độ 5 × 10 8 tế bào/mL và cố định bằng 100 % metanol. Sau đó, lam kính được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa và gắn bằng chất lỏng gắn lam kính Permount. Hai trăm tế bào máu được đếm cho mỗi mẫu. Hoạt động thực bào, được định nghĩa là tỷ lệ thực bào được biểu thị bằng:

Tỷ lệ thực bào = (tế bào máu thực bào/tổng ​​số tế bào máu) × 100

  1. Hoạt tính phenoloxidase

Hoạt tính phenoloxidase được đo bằng phương pháp đo quang phổ bằng cách ghi lại sự hình thành dopachrome được tạo ra từ l-dihydroxyphenylalanine, sau khi sửa đổi một quy trình đã được công bố (Supamattaya và cộng sự 2000 ). Hỗn hợp tan máu-chống đông máu được rửa ba lần bằng nước muối tôm và ly tâm ở 1000 vòng/phút và 4°C trong 10 phút. Lysate tế bào máu được điều chế từ các tế bào máu trong dung dịch đệm cacodylate (pH 7,4; natri cacodylate 0,01 M, natri clorua 0,45 M, canxi clorua 0,01 M và clorua magiê 0,26 M; pH 7,0) bằng cách sử dụng máy siêu âm ở biên độ 30 trong 5 giây và huyền phù sau đó được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở 4°C trong 20 phút và thu lấy phần nổi phía trên. Sau đó, 200 µL trypsin 0,25% trong dung dịch đệm cacodylate được trộn vào 200 µL dịch ly giải tế bào máu, sau đó là 200 µL l-dihydroxyphenylalanine ở mức 4 mg/mL làm cơ chất. Hoạt tính của enzyme được đo bằng độ hấp thụ của dopachrome ở bước sóng 490 nm. Hàm lượng protein trong dịch ly giải tế bào máu được đo theo một quy trình đã được công bố (Lowry và cộng sự 1951 ). Hoạt tính phenoloxidase được tính bằng mức tăng mật độ tối ưu mỗi phút trên mỗi miligam protein.

  1. Hoạt động của Superoxide disutase

Hoạt tính SOD được đo bằng khả năng ức chế các phản ứng phụ thuộc gốc superoxide bằng cách sử dụng Ransod Kit (Randox, Crumlin, UK). Phương pháp này dựa trên sự hình thành formazan màu đỏ trong phản ứng của 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium clorua (INT) và gốc superoxide, được phân tích trong máy đo quang phổ ở bước sóng 505 nm . Hỗn hợp phản ứng (1,7 mL) chứa 0,05 mM xanthine và 0,025 mM INT hòa tan trong 50 mM CAPS (pH 10,2) và 0,94 mM EDTA. Với sự hiện diện của xanthine oxidase, superoxide và axit uric được tạo ra từ xanthine. Các gốc superoxide sau đó phản ứng với INT để tạo ra thuốc nhuộm formazan màu đỏ. Hỗn hợp tan máu-chống đông máu được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút và 4°C trong 10 phút. Huyết tương được loại bỏ và cặn được hòa lại với 3 mL NaCl 0,9% và ly tâm lại. Phần nổi phía trên được loại bỏ và cặn được hòa lại với 2 mL nước cất ba lần ở 4°C. Một lượng 50 µL tế bào máu được treo lại được đặt vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng chứa 200 µL hỗn hợp phản ứng. Năm mươi microlit dung dịch xanthine oxidase được thêm vào mỗi giếng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 505 nm và 37°C. Tốc độ phản ứng được ước tính từ số đọc độ hấp thụ là 0,5 và 3 phút sau khi thêm xanthine oxyase. Một tiêu chuẩn tham chiếu của SOD đã được cung cấp cùng với Ransod Kit. Một đơn vị SOD được định nghĩa là lượng cần thiết để ức chế tốc độ giảm xanthine xuống 50%. Hoạt độ cụ thể được biểu thị bằng đơn vị SOD/mL.

  1. Hoạt tính diệt khuẩn

Hoạt tính diệt khuẩn được đo lường theo mô tả của Supamattaya et al. (2000). Huyết thanh được tách ra khỏi tế bào máu của từng mẫu tôm trước khi pha loãng trong NaCl 2,6% theo tỷ lệ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 và 1:32. Sau đó, 0,5 mL của mỗi độ pha loãng huyết thanh được sử dụng để xét nghiệm. Đối với đối chứng âm tính, 0,1 mL NaCl đã được sử dụng trong xét nghiệm. Một phần mười mililit huyền phù Vibrio harveyi (8,2 × 10 6 CFU/mL) đã được thêm vào mỗi độ pha loãng huyết thanh và đối chứng. Các phương pháp xử lý được ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ trước khi đếm vi khuẩn. Kết quả được ghi nhận từ độ pha loãng có thể làm giảm 50% V. harveyi so với đối chứng.

Kết quả

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của axit formic và astaxanthin đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

Sau 60 ngày cho ăn, tôm được cho ăn AX 50 ppm có trọng lượng cơ thể trung bình cao nhất (4,45 ± 0,45 g), tiếp theo là tôm được cho ăn 0,3 % FA + 50 ppm AX (4,38 ± 0,37 g), 0,6 % FA + 50. ppm AX (4,05 ± 0,21 g) và nhóm đối chứng (4,18 ± 0,05 g). Tuy nhiên, trọng lượng cơ thể của tất cả tôm được cho ăn axit formic và astaxanthin không khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng. Tỷ lệ sống trung bình của tôm được nuôi bằng 0,6 % FA + 50 ppm AX là 82,33 ± 8,32 %, cao nhất trong số tất cả các nhóm khác và cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (64,33 ± 10,12 %) (Tài liệu bổ sung 1 : Bảng S1).

Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của axit formic và astaxanthin đến sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, vi khuẩn đường ruột và phản ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương bị nhiễm Vibrio parahaemolyticus.

Khi kết thúc thử nghiệm cho ăn, mức tăng trọng trung bình 0,3 % FA + 50 ppm tôm được cho ăn bằng AX là cao nhất, là 2,97 ± 0,83 g. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể giữa sáu nhóm thử nghiệm được quan sát. Tỷ lệ sống trung bình của tất cả tôm được cho ăn FA và AX cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (20,00 ± 17,32%) và kết quả tốt nhất thu được ở nhóm cho ăn 0,6% FA + 50 ppm AX (67,50 ± 3,33%) ( File bổ sung 1 : Bảng S2).

Đối với nghiên cứu vi khuẩn đường ruột, cả Vibrio spp. số lượng và tổng số vi khuẩn của cả bốn nhóm được cho ăn FA (cụ thể là 0,3% FA, 0,6% FA, 50 ppm AX + 0,3% FA và 50 ppm AX + 0,6% FA) thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng và 50 ppm. Các nhóm được cho ăn bằng AX trong suốt quá trình thử nghiệm cho ăn. Số lượng vi khuẩn đường ruột thấp nhất được quan sát thấy ở tôm có chế độ ăn chứa liều FA cao (tức là 0,6% FA). Vào ngày thí nghiệm thứ 30, hai vi khuẩn Vibrio spp. số lượng được quan sát thấy ở 50 ppm AX + 0,6 % FA và 0,6 % FA (tương ứng là 1,30 ± 0,58 và 1,60 ± 0,70 × 10 6 CFU/g), trong khi số lượng cao nhất là ở nhóm đối chứng (47,20 ± 25,40 × 10 6 CFU/g). Tương tự, hai tổng số vi khuẩn thấp nhất là ở nhóm 0,6 % FA và 50 ppm AX + 0,6 % FA (lần lượt là 2,80 ± 1,30 và 3,10 ± 0,70 × 10 6 CFU/g), trong khi số lượng cao nhất là ở nhóm đối chứng. (45,00 ± 27,40 × 10 6 CFU/g) (Hình. 1,​,22).

Hình 1 Tổng số Vibrio spp. (106 CFU/g) trong ruột tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 5) sau khi gây cảm nhiễm với V. parahaemolyticus ở mức 104 CFU/ml. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau phía trên các thanh cho biết liệu các giá trị trung bình có khác biệt đáng kể với nhau hay không (p < 0,05)

Hình 1 Tổng số Vibrio spp. (106 CFU/g) trong ruột tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 5) sau khi gây cảm nhiễm với V. parahaemolyticus ở mức 104 CFU/ml

Hình 2 Tổng số vi khuẩn (106 CFU/g) trong ruột tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 5) sau khi gây nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở nồng độ 104 CFU/mL. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau phía trên các thanh cho biết liệu các giá trị trung bình có khác biệt đáng kể với nhau hay không (p < 0,05)

Hình 2 Tổng số vi khuẩn (106 CFU/g) trong ruột tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 5) sau khi gây nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở nồng độ 104 CFU/mL axit formic và astaxanthin

Các thông số miễn dịch của tôm bị ảnh hưởng đáng kể bởi AX trong thức ăn cho tôm. Tôm được nuôi bằng chế độ ăn có chứa AX (cụ thể là 50 ppm AX + 0,3% FA, 50 ppm AX + 0,6% FA và 50 ppm AX) có tổng số lượng tế bào máu (THC) (Hình 2). 3), hoạt động thực bào (Hình 2). 4) và hoạt tính phenoloxidase (PO) (Hình 2). 5) cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng và nhóm FA. Hoạt tính Superoxide dismutase (SOD) (Hình 2). 6) của tôm được cho ăn AX 50 ppm nhưng không thấy ở nhóm 50 ppm AX + 0,3 % FA và 50 ppm AX + 0,6 % FA cho thấy mức tăng đáng kể so với tôm không cho ăn AX. Tuy nhiên, hoạt tính diệt khuẩn của huyết thanh tôm ở tất cả các nhóm ở cùng độ pha loãng huyết thanh, là 1:4 (Tệp bổ sung 1 : Bảng S3).

Hình 3 Tổng số lượng tế bào máu (105  tế bào/ml) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi thử thách với Vibrio parahaemolyticus ở mức 104 CFU /mL. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau phía trên các thanh cho biết liệu các giá trị trung bình có khác biệt đáng kể với nhau hay không (p < 0,05)

Hình 3 Tổng số lượng tế bào máu (105  tế bào/ml) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

Hình 4 Hoạt tính thực bào (%) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi gây nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở nồng độ 10 4 CFU/mL. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau phía trên các thanh cho biết liệu các giá trị trung bình có khác biệt đáng kể với nhau hay không (p < 0,05)

Hình 4 Hoạt tính thực bào (%) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi gây nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở nồng độ 10 4 CFU/mL axit formic và astaxanthin

Hình 5 Hoạt tính phenoloxidase (đơn vị/phút/mg protein) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi gây cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus ở mức 104 CFU /ml. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau phía trên các thanh cho biết liệu các giá trị trung bình có khác biệt đáng kể với nhau hay không (p < 0,05)

Hình 5 Hoạt tính phenoloxidase (đơn vị/phút/mg protein) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi gây cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus ở mức 104 CFU /ml

Hình 6 Hoạt tính superoxide dismutase (đơn vị SOD/mL) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi gây cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus ở mức 104 CFU /ml. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau phía trên các thanh cho biết liệu các giá trị trung bình có khác biệt đáng kể với nhau hay không (p < 0,05)

Hình 6 Hoạt tính superoxide dismutase (đơn vị SOD/mL) của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (n = 10) sau khi gây cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus ở mức 104 CFU /ml. axit formic và astaxanthin

Cuộc thảo luận

Axit hữu cơ được sử dụng rộng rãi làm chất phụ gia và chất bảo quản thực phẩm động vật để ngăn ngừa sự hư hỏng của thực phẩm. Là một nhóm, các hợp chất này chủ yếu bao gồm các axit monocarboxylic mạch thẳng bão hòa và các dẫn xuất của chúng (Ricke 2003 ). Nhiều loại trong số chúng có sẵn dưới dạng muối natri, kali hoặc canxi vì chúng thường không mùi, dễ xử lý hơn, ít ăn mòn hơn và có thể hòa tan cao hơn axit tự do (Papatsiros và Billinis 2012 ). Axit hữu cơ có hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli , Salmonella spp., và Vibrio spp. (Ricke 2003 ; Papatsiros và Billinis 2012 ; da Silva và cộng sự 2013 ). Các dạng axit hữu cơ không phân ly có thể dễ dàng xâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn và phân ly thành các anion và H + trong tế bào chất (Ricke 2003 ; Beales 2004 ; Lückstädt và Mellor 2011 ). Khi vào bên trong tế bào vi khuẩn, chúng làm giảm độ pH nội bào và phá vỡ màng tế bào chất, hệ thống tổng hợp protein, vật liệu di truyền và các enzyme chuyển hóa. Ngoài ra, do tế bào vi khuẩn sử dụng ATP để bơm lượng H + dư thừa ra khỏi tế bào nên axit hữu cơ cũng làm cạn kiệt lượng ATP và ảnh hưởng đến khả năng duy trì cân bằng pH nội môi của tế bào (Ricke 2003 ; Beales 2004 ; Lückstädt và Mellor 2011 ). Tuy nhiên, không phải tất cả các axit hữu cơ đều có tác dụng đối với vi khuẩn. Trên thực tế, các axit hữu cơ liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu là các axit chuỗi ngắn (C1–C7) và là các axit monocarboxylic đơn giản như axit formic, acetic, propionic và butyric, hoặc là axit cacboxylic mang nhóm hydroxyl như lactic, axit malic, tartaric và citric (Dibner và Buttin 2002 ; Papatsiros và Billinis 2012 ).
Axit hữu cơ chủ yếu được sử dụng làm phụ gia thức ăn để cải thiện hiệu suất tăng trưởng của lợn và gia cầm (Dibner và Buttin 2002 ; Franco và cộng sự 2005 ; Lückstädt và Mellor 2011 ; Papatsiros và Billinis 2012 ); cũng có những báo cáo về lợi ích của axit hữu cơ đối với động vật thủy sản, bao gồm cá rô phi lai đỏ (Ng và cộng sự 2009 ; Koh và cộng sự 2014 ), cá đuôi vàng (Sarker và cộng sự 2012 ), cá tầm (Khajepour và Hosseini 2012 ), rohu (Baruah và cộng sự 2007 ), tôm sú (Ng và cộng sự 2015 ), và tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Walla và cộng sự 2012 ; da Silva và cộng sự 2013 ; Su và cộng sự 2014 ; Romano và cộng sự 2015 ). Tuy nhiên, kết quả từ thí nghiệm 1 cho thấy tôm được cho ăn FA có trọng lượng cơ thể thấp hơn đáng kể so với tôm được cho ăn 50 ppm AX và tốc độ tăng trưởng kém hơn một chút so với nhóm đối chứng. Điều này chỉ ra rằng axit formic không thúc đẩy sự phát triển của tôm và có thể có một số tác động tiêu cực đến sự phát triển của tôm. Các axit béo chuỗi ngắn khác có thể thúc đẩy sự tăng trưởng, ví dụ, hỗn hợp axit hữu cơ 2% (bao gồm hỗn hợp axit formic, lactic, malic và citric) (Romano et al. 2015 ) hoặc 2 g/kg axit xitric (Su et al. cộng sự 2014 ).
Mặc dù không có sự cải thiện rõ ràng về tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống của hậu ấu trùng tôm không bị nhiễm bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi, việc sử dụng axit formic đã làm tăng tỷ lệ sống sót của tôm con bị nhiễm V. parahaemolyticus đáng kể so với nhóm đối chứng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột, tức là tôm được cho ăn axit formic có Vibrio spp thấp hơn đáng kể. và tổng số vi khuẩn so với những con không được cho ăn axit formic. Điểm giống nhau giữa Vibrio spp. số lượng và tổng số vi khuẩn cho thấy Vibrio spp. là thành phần quan trọng của hệ vi sinh đường ruột tôm (Moss và cộng sự 2000 ; Oxley và cộng sự 2002 ; Liu và cộng sự 2011 ). Tác dụng kháng khuẩn của axit formic đối với Vibrio spp. cũng được báo cáo trong ống nghiệm (Mine and Boopathy 2011 ; Adams và Boopathy 2013 ; da Silva et al. 2013 ). Xem xét tất cả các khía cạnh này, đặc tính kháng khuẩn của axit formic có thể làm giảm sự lây nhiễm Vibrio sang tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Papatsiros và Billinis 2012 ; Adams và Boopathy 2013 ; da Silva et al. 2013 ) bằng cách xâm nhập vào thành tế bào của vi khuẩn ở dạng không phân ly, sau đó giải phóng H + và làm mất ổn định độ pH nội bào của tế bào chất vi khuẩn, dẫn đến tử vong (da Silva et al. 2013 ).
Astaxanthin là một sắc tố thuộc lớp xanthophyll (dẫn xuất oxy hóa của carotenoids) và được sử dụng rộng rãi trong nuôi cá hồi và giáp xác để tạo ra màu đỏ cam mong muốn. Astaxanthin sở hữu đặc tính chống oxy hóa mạnh và có vai trò quan trọng trong sự phát triển của ấu trùng và thành công sinh sản của động vật giáp xác. Nó xuất hiện tự nhiên trong vi tảo lục Haematococcus pluvialis và nấm men đỏ Xanthophyllomyces dendrorhous ( Phaffia rhodozyma ). Tuy nhiên, vì các loài giáp xác nuôi thường không có cơ hội tiếp cận nguồn astaxanthin tự nhiên và chúng không thể tổng hợp carotenoids de novo nên tổng lượng astaxanthin phải được lấy từ thức ăn của chúng (Higuera-Ciapara và cộng sự 2006 ; Seabra và Pedrosa 2010 ).

Sự tăng trưởng của tôm được cho ăn bằng astaxanthin trong thí nghiệm 1 tốt hơn đáng kể so với tôm được cho ăn bằng FA, nhưng không khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng. Tỷ lệ sống của tôm được nuôi bằng astaxanthin không khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, tỷ lệ sống của tôm nhiễm V. parahaemolyticus trong thí nghiệm 2 được cải thiện đáng kể. Tuy nhiên, không giống như axit formic, astaxanthin không ức chế quần thể vi khuẩn đường ruột, cho thấy các cơ chế khác có thể là nguyên nhân làm tăng tỷ lệ sống sót. Trên thực tế, nhiều thông số miễn dịch của tôm được cho ăn astaxanthin đã được cải thiện, bao gồm tổng số lượng tế bào máu (THC), hoạt động thực bào, hoạt động phenoloxidase (PO) và hoạt động superoxide dismutase (SOD). Những kết quả này cho thấy astaxanthin có đặc tính kích thích miễn dịch ngăn ngừa nhiễm V. parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương.

Hoạt động chống oxy hóa của carotenoids có thể liên quan đến tác dụng điều hòa miễn dịch; bằng cách dập tắt oxy nhóm đơn và các gốc tự do, carotenoid có thể bảo vệ các tế bào bạch cầu khỏi tổn thương oxy hóa (Bendich 1989 ). Superoxide dismutase (SOD) là một enzyme chống oxy hóa giúp bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa bằng cách loại bỏ anion superoxide (O 2 − ) và nó được sử dụng như một chỉ số phản ứng miễn dịch (Campa-Córdova et al. 2002a , 2002b ). Cho rằng astaxanthin cũng có đặc tính chống oxy hóa, điều này cho thấy cơ chế đó phải tham gia vào quá trình điều hòa miễn dịch. Hơn nữa, tác dụng của carotenoids trong việc tăng cường phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và thể dịch của động vật có xương sống cũng được ghi nhận (Bendich 1989 ; Chew và Park 2004 ). Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng carotenoid trong chế độ ăn uống có thể làm tăng các thông số miễn dịch, nâng cao tỷ lệ sống sót hoặc hoạt động như một chất phòng ngừa mầm bệnh cho nhiều loài động vật thủy sinh như cá chép thông thường (Anbazahan et al. 2014 ; Sowmya và Sachindra 2015 ), cá hồi vân (Amar). et al. 2001 ), tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Flores et al. 2007 ; Niu et al. 2009 ), tôm sú (Supamattaya et al. 2005 ), tôm kuruma (Chien và Shiau 2005 ) và tôm nước ngọt khổng lồ (Angeles et al. cộng sự 2009 ). Kết quả của chúng tôi có phần giống với những nghiên cứu này.

Ngay cả khi axit formic và astaxanthin có các phương thức hoạt động khác nhau đối với tôm, cả hai đều có tác động tích cực đến khả năng chống lại thách thức của vi khuẩn. Trong khi đó, kết quả của chúng tôi cho thấy sự kết hợp giữa axit formic và astaxanthin không tốt hơn so với sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp. Ngoại lệ duy nhất là tôm không bị nhiễm bệnh được cho ăn 0,6% FA + 50 ppm AX có tỷ lệ sống cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Nhìn chung, axit formic (FA 0,3 và 0,6%) và astaxanthin (50 ppm AX) có hiệu quả như nhau trong việc ngăn ngừa nhiễm V. parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương. Do thực tế là axit formic rẻ hơn astaxanthin nên việc sử dụng axit formic làm phụ gia thức ăn trong nuôi tôm có thể được coi là có giá trị kinh tế hơn.

Phần kết luận

Astaxanthin (50 ppm AX) có thể được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương không bị nhiễm bệnh, trong khi axit formic (0,3 và 0,6% FA) và AX có thể nâng cao tỷ lệ sống của tôm nhiễm Vibrio parahaemolyticus trong điều kiện phòng thí nghiệm. Ngoài ra, tôm được nuôi bằng FA có vi khuẩn Vibrio spp. và tổng số vi khuẩn, trong khi tôm được cho ăn bằng AX cho thấy sự cải thiện ở nhiều thông số miễn dịch. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng sử dụng FA, AX và sự kết hợp của chúng làm phụ gia thức ăn có thể ngăn ngừa nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở tôm.

Nguồn tham khảo:

Effect of dietary formic acid and astaxanthin on the survival and growth of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) and their resistance to Vibrio parahaemolyticus

Niti Chuchird,corresponding author Phitsanu Rorkwiree, and Tirawat Rairat